喉鱗癌患者術后組織中神經纖毛蛋白1、2的表達及對血管生成的作用

焦勝敏 (廊坊衛生職業學院，河北 廊坊 065001)

喉鱗癌患者術后組織中神經纖毛蛋白1、2的表達及對血管生成的作用

焦勝敏 (廊坊衛生職業學院，河北 廊坊 065001)

目的觀察喉鱗癌組織中神經纖毛蛋白(NRP)1、2的表達特點，關注二者對腫瘤中CD34陽性的血管生成的作用。方法收集79例喉鱗癌標本作為觀察組，收集53例正常喉黏膜組織作為對照組，應用免疫組織化學技術檢測二組中NRP1、NRP2和CD34的表達，分析其在不同臨床特征中的表達差別及相關性。結果喉鱗癌中NRP1、NRP2表達的陽性率和CD34標記的微血管密度(MVD)明顯高于對照組，觀察組中NRP1、NRP2表達的陽性率和MVD與腫瘤體積、淋巴結轉移、淋巴結轉移數量及Ki67的表達密切相關，線性相關分析顯示NRP1和MVD、NRP2和MVD具有正相關性，生存分析顯示NRP1、NRP2和MVD與患者的預后相關。結論NRP1、NRP2和MVD高表達在喉鱗癌的發生發展中具有重要作用，NRP1、NRP2具有促進CD34陽性的血管生成的作用，聯合檢測NRP1、NRP2和MVD可能與喉鱗癌的預后密切相關。

喉鱗癌;神經纖毛蛋白(NRP)1;NRP2;CD34;免疫組織化學

喉鱗癌發生與發展是多因素綜合作用的結果。腫瘤進展過程由多種基因和蛋白調控。神經纖毛蛋白(NRP)家族是Semaphorins成員的受體，其具有兩個重要成員，即 NRP1、NRP2，二者在惡性腫瘤中高表達，近年來研究顯示 NRP1和NRP2可能對腫瘤中的血管生成有重要的促進作用〔1〕。CD34是血管新生的重要標志物，對血管內皮的標記作用強〔2〕。本實驗探討喉鱗癌組織中NRP1和NRP2的表達特征，關注二者對CD34陽性的血管密度(MVD)的作用，探討其表達的臨床價值及對判斷預后的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 廊坊市人民醫院2005年1月至2006年7月存檔的喉鱗癌標本的蠟塊79例作為觀察組，均符合WHO中關于喉鱗癌的診斷標準，并經病理科專家確診。年齡54～79(平均59.2)歲，腫瘤大小0.5～5.3 cm。同時選取同期病理證實為正常喉黏膜組織53例作為對照組。二組在一般臨床資料的比較中無明顯差別，具有可比性。

1.2 方法 NRP1、NRP2和CD34的濃縮液均購自武漢博士德生物技術有限公司，實驗前均進行預實驗，選擇最理想稀釋濃度用于正式實驗。免疫組化應用SP法完成，嚴格質量控制。具體步驟:脫蠟后置于自來水中進行水化，3%H2O2去離子水孵育10 min后，行抗原修復，加入稀釋好的 NRP1、NRP2或CD34一抗蛋白，在室溫中孵育2 h，應用 PBS進行沖洗，5 min×3次;加入二抗，在室溫中孵育20 min，應用PBS進行沖洗，5 min×3次;加入辣根酶標記鏈霉卵白素，在室溫中孵育半小時，應用PBS進行沖洗，5 min×3次;加入DAB進行顯色后自來水沖洗，按常規操作進行封片。

1.3 結果判定標準 NRP1、NRP2蛋白的陽性細胞均位于細胞質中，以染成棕黃或棕褐色為陽性，隨機觀察計數10個高倍視野的NRP1、NRP2蛋白的陽性表達細胞數的百分率，取其平均值，以平均每個高倍鏡視野的陽性腫瘤細胞數≥25%為陽性，以 ＜25%為陰性，計算陽性率。MVD的判斷方法:確定CD34染色細胞叢作為一個血管，先在低倍鏡下全面觀察切片以確定腫瘤內血管密度最高處。再在高倍鏡下，以與周圍腫瘤細胞和結締組織成分明顯區別的任何一個棕色染色的內皮細胞或細胞叢為一個血管，只要結構不相連，其分支結構也作為一個血管計數。記錄5個視野內的微血管數，取其平均數。

1.4 統計學方法 應用SAS6.12統計軟件，采用χ2檢驗或t檢驗，并進行線性相關性分析和生存分析。

2 結果

2.1 NRP1、NRP2和MVD在觀察組與對照組中的表達 由表1可見，觀察組與對照組中NRP1、NRP2表達的陽性率和CD34標記的微血管密度差別顯著(P＜0.01)。

2.2 NRP1、NRP2和MVD在觀察組中不同臨床特征中的表達比較 觀察組中NRP1、NRP2和MVD與腫瘤直徑、淋巴結轉 移、淋巴結轉移數量及Ki67的表達密切相關。見表2。

表1 NRP1、NRP2陽性表達和MVD在觀察組與對照組中的表達

2.3 喉鱗癌組織中NRP1、NRP2和MVD表達的關系 對觀察組中NRP1、NRP2和MVD的表達進行線性相關性分析，結果顯示 NRP1和 NRP2(r=0.45，P=0.022 1)、NRP1 和 MVD(r=0.43，P=0.014 2)、NRP2 和 MVD(r=0.43，P=0.035 9)均呈正相關性。

2.4 喉鱗癌組織中NRP1、NRP2和MVD的表達與生存的關系隨訪時間7～60(平均37.5)個月。經生存分析顯示，NRP1(χ2=6.15，P=0.022 4)、NRP2(χ2=8.35，P=0.017 6)和 MVD(χ2=10.09，P=0.010 9)的表達與預后相關，即 NRP1、NRP2 和MVD高表達患者的預后差。

3 討論

NRP1和NRP2常表達在內皮細胞及一些腫瘤細胞，是神經生長因子抑制因子Sema 3A和血管內皮生長因子165的受體，因此NRP1和NRP2對神經軸突的生長及血管的生成有重要促進作用。NRP1和NRP2是潛在血管生成因子，其在腫瘤細胞惡變及血管化中高表達，尤其是當NRP1和NRP2高表達時常伴隨著血管內皮生長因子的高表達。有研究通過體內誘導AT2.1細胞表達NRP1時，可以引起腫瘤體積的增加，腫瘤部位新生毛細血管密度增加〔3〕，內皮細胞增殖，血管擴張，此時腫瘤的凋亡指數下降〔4〕。因此NRP1和NRP2可能類似癌基因的作用，也可能通過VEGF的過表達引起腫瘤的血管增生，使腫瘤增大，加速腫瘤的進展。血管生成是當今人們關注的重要生物學行為，其調節蛋白關系復雜，通路作用多〔5〕。CD34是現今被人們認為標記血管生成的最好標記物，在血管新生方面明顯優于Ⅷ因子等血管標記物〔6〕。腫瘤分泌多種成血管信號時，腫瘤血管可以由周圍正常組織的固有血管向腫瘤組織內容延伸而成，也可以通過內皮細胞前體細胞分化后形成內皮依賴性血管。NRP1、NRP2與腫瘤的血管生成可能具有內在關系，并已引起學者們的關注。

本研究結果提示NRP1、NRP2和血管密度在腫瘤進展中具有重要作用;且NRP1、NRP2可能參與腫瘤的進展及淋巴道轉移。由于以上因素均與預后相關，因此聯合檢測NRP1、NRP2和MVD表達可能與預后相關，生存分析結果證實了此結論，即NRP1、NRP2和MVD高表達喉鱗癌患者的預后差。線性相關分析結果顯示NRP1、NRP2和MVD具有協同正向作用，提示三者具有正向協同作用，NRP1、NRP2可能作為上游蛋白，具有直接調節CD34陽性的血管生成，其次NRP1、NRP2之間的作用也可能通過VEGF聯系起來，通過脈管的激活與脈管的生成而發揮協同作用，因此NRP1和 CD34標記的MVD，NRP2和CD34標記的MVD均可能具有通路作用。而且NRP1、NRP2還可能參與鱗癌相關蛋白的增殖反應，或激活其他癌基因和轉移相關基因，共同促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。

1 張 佳，張速勤，董 頻，等.喉鱗癌組織中NRP-1、VEGF的表達變化及意義〔J〕.山東醫藥，2012;50(18):95-6.

2 張更琳，孔維佳.Neuropilin-1在喉癌組織及喉癌細胞系中的表達〔J〕.臨床耳鼻咽喉科雜志，2006;20(14):634-5.

3 陳 潔，張紅闖，宋曉萌，等.NRP1、NRP2及SEMA 3F在口腔癌組織及TCa、ACC細胞系中的表達及其可能的作用〔J〕.口腔醫學，2009;29(5):235-7.

4 慶琳琳，李建生，師曉天.Neuropilin1在食管鱗癌中的表達及其意義〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2005;14(4):386-8.

5 劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質金屬蛋白酶-9和CD105表達關系的研究〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(7):886-7.

6 Yang P，Yuan W，He J.Overexpression of EphA2，MMP-9，and MVDCD34 in hepatocellular carcinoma:Implications for tumor progression and prognosis〔J〕.Hepatol Res，2009;39(12):1169-77.

R739.65

A

1005-9202(2013)05-1037-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.022

焦勝敏(1972-)，女，碩士，高級講師，副主任中醫師，主要從事中西醫結合治療眼疾病研究。

〔2012-05-21收稿 2012-09-10修回〕

(編輯 張海彬)