α-萘酚-硫酸法測(cè)定酒糟多糖含量

張世仙，劉 焱，朱 彬，金 茜，曾啟華

(遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563002)

多糖是由10個(gè)以上的單糖分子通過(guò)糖苷鍵結(jié)合而成的物質(zhì)，多糖是一切有生命的有機(jī)體必不可少的成分，是構(gòu)成動(dòng)植物骨架結(jié)構(gòu)的組成成分，多糖與維持生命的種種生理機(jī)能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與衰老，有些多糖具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血壓、鎮(zhèn)痛、抗輻射等藥效[1-5]。貴州省是釀酒大省，大多數(shù)白酒是用當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的高粱和小麥為原料通過(guò)酒曲發(fā)酵而成，其最大副產(chǎn)物——酒糟中殘存著大量的多糖、被富集的蛋白質(zhì)、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，是提取酒糟多糖的較好原料。

對(duì)多糖的定量測(cè)定可以采用兩種方法[8-17]：一是利用多糖中的還原糖與試劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)顯色測(cè)定，如3,5-二硝基水楊酸鹽(DNS)比色法和Somogyi-Nelson法；二是將多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，如苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。其中苯酚-硫酸法是常用的一種經(jīng)典方法，但是苯酚毒性大、易氧化，其提純操作較難控制，文獻(xiàn)[18]報(bào)道用萘酚-硫酸法測(cè)定白果多糖的含量，方法可行和容易操作。本實(shí)驗(yàn)嘗試用a-萘酚-硫酸法測(cè)定酒糟多糖的含量，以建立酒糟多糖含量的測(cè)定方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒糟 貴州省某酒廠提供；α-萘酚(分析純) 湘中化學(xué)試劑開發(fā)中心；葡萄糖(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇(分析純)、濃硫酸(分析純) 成都市科龍化工試劑廠。

722型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TB-214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-2C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；0412-1型離心機(jī)上海手術(shù)器械廠；真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 酒糟多糖的提取工藝[19-22]

新鮮酒糟粉→在料水比1∶12條件下，用鹽酸調(diào)pH值至5.0～5.5→控制溫度用水解蛋白酶降解酒糟中的蛋白質(zhì)→離心→pH值調(diào)至中性→濃縮→4倍體積95%乙醇沉淀→靜置→過(guò)濾→冷凍干燥→酒糟多糖

1.2.2 溶液配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用二次蒸餾水定容至500mL，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

樣品溶液：精密稱取樣品0.2200g，用二次蒸餾水定容至50mL，移取10mL，用二次蒸餾水定容至100mL，即為0.44mg/mL待測(cè)樣品溶液。

1.5g/100mLα-萘酚溶液：準(zhǔn)確稱取1.5gα-萘酚，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液溶解并定容至100mL，即為1.5g/100mLα-萘酚溶液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶，于4℃冰箱保存、備用。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)確定

準(zhǔn)確移取1mL 0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL比色管中，加入1mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，搖勻并迅速加入5mL濃硫酸，充分混合，室溫放置至無(wú)氣泡后(約20min)，在410～710nm波長(zhǎng)區(qū)域測(cè)定吸光度，并以試劑空白為對(duì)照。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、15、20、30、35、40、45mL于50mL容量瓶中定容，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，于560nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比測(cè)吸光度。

1.2.5 換算因子的測(cè)定[12-14]

準(zhǔn)確移取1.2.2節(jié)中的樣品溶液1mL，用二次蒸餾水定容于10mL容量瓶中。取1.0mL溶液5份，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算多糖中葡萄糖平均含量，按下式(1)計(jì)算出換算因子f。

式中：m為多糖質(zhì)量/mg；ρ為樣品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；D為多糖的稀釋倍數(shù)；V為體積/mL。

1.2.6 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確移取1mL質(zhì)量濃度為0.44mg/mL樣品溶液3份，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算葡萄糖含量，按式(2)計(jì)算得出酒糟多糖含量。

式中：W為樣品的質(zhì)量/mg；其他量符號(hào)含義同式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)確定

取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)所得的吸收曲線見圖1。從圖1可見，最大吸收峰波長(zhǎng)為560nm。

圖1 α-萘酚-硫酸法確定多糖最大吸收波長(zhǎng)Fig.1 The maximum absorption wavelength for naphthol-vitriol photometric determination of polysaccharide

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

根據(jù)1.2.4節(jié)方法，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0255ρ＋0.0419，R2=0.9975，葡萄糖在6～36μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3 測(cè)定方法的考察

2.3.1 顯色時(shí)間的確定

準(zhǔn)確移取1mL樣品溶液，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，每隔10min測(cè)定1次吸光度，連續(xù)測(cè)定50min，結(jié)果見圖2。

圖2 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響(n=3)Fig.2 Effect of coloration time on absorbance (n=3)

由圖2可見，冷卻至室溫后的20min內(nèi)吸光度很穩(wěn)定，30min后吸光度雖然有所下降，但下降趨勢(shì)不明顯，因此按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)的時(shí)間控制在20min之內(nèi)。

2.3.2α-萘酚溶液添加量的確定

在盛有1.0mL一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的5支比色管中，各加入1.0mL二次蒸餾水和1.5g/100mL的α-萘酚溶液0.2、0.6、0.8、1.0、1.2mL，再分別加入2.5mL濃硫酸，另取一支比色管作空白，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)并測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，當(dāng)1.5g/100mL的α-萘酚溶液加入量為1.0mL時(shí)，吸光度較大，見圖3。

圖3 α-萘酚添加量對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of α-naphthol dosage on absorbance

2.3.3α-萘酚溶液質(zhì)量濃度的確定

取6支比色管，分別加入1.0mL一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入質(zhì)量濃度為0、0.500、0.750、0.875、1.500、1.750g/100mL的α-萘酚溶液，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)并測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，使用1.500g/100mLα-萘酚溶液，吸光度最大，見圖4。

圖4 α-萘酚質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of α-naphthol concentration on absorbance

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取1mL 一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于11支比色管中，加雙蒸水1.0mL，再加入1.0mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，按1.4.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定11次，得吸光度分別為0.904、0.898、0.900、0.900、0.898、0.899、0.901、0.900、0.899、0.900、0.899，計(jì)算RSD為0.18%。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取1mL 0.44mg/mL的樣品溶液于8支比色管，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，得吸光度分別為0.686、0.686、0.685、0.684、0.686、0.686、0.684、0.685，計(jì)算RSD為0.14%。

2.4.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取2mL 0.44mg/mL的樣品溶液于10mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，取1mL按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測(cè)得吸光度，換算含糖量平均值為0.945μg/mL。再取4支10mL容量瓶，各加入2mL該樣品溶液，并分別加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二次蒸餾水定容至刻度，取1mL按1.2.3節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=4)Table 1 Recovery rates of glucose from spiked sample (n=4)

從表1可見，平均回收率為100.65%，RSD為6.5%。2.4.4 換算因子的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)測(cè)得1.2.5節(jié)中樣品溶液的吸光度為0.585、0.585、0.593、0.588、0.586。由回歸方程計(jì)算出酒糟多糖中葡萄糖平均含量為21.392μg/mL，按換算因子公式計(jì)算出f＝2.057(n=5)。

2.5 樣品測(cè)定

將1.2.6節(jié)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的吸光度代入回歸方程計(jì)算葡萄糖含量，再通過(guò)多糖含量公式計(jì)算得出酒糟多糖平均含量為10.6%，RSD為4.0%(n=3)。

3 結(jié) 論

α-萘酚-硫酸法測(cè)定酒糟多糖含量實(shí)驗(yàn)表明：樣品與5mL濃硫酸反應(yīng)，用1.5g/100mLα-萘酚1.0mL顯色，于560nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，回收率較高。

α-萘酚-硫酸法與常用的苯酚-硫酸法相比，測(cè)定酒糟多糖含量的步驟基本一致，但是α-萘酚-硫酸法在操作、試劑消耗等方面更具優(yōu)勢(shì)，適合酒糟多糖含量的測(cè)定。

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