幾種常見食用菌胞外酶活性測定方法的研究1）

呂春鶴，孫婷婷，張健，孟東陽，鄒莉

（東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040）

食用菌在生長發育過程中產生胞外酶，食用菌胞外酶可以分解培養料使多糖、蛋白質、核酸等天然高聚物裂解成食用菌菌絲和子實體便于吸收的小分子物質，為食用菌菌絲生長、原基形成、子實體生長發育提供營養物質［1］。因此，食用菌胞外酶在食用菌生長發育過程中起著至關重要的作用，其胞外酶的酶活力也就成為了重要的測定對象。通過對酶活的測定可以清晰地看出各種胞外酶對菌料的分解程度與分解效率，以便于使食用菌菌絲及子實體更好更快生長。并且就食用菌的生長發育過程來看，了解食用菌胞外酶活性的變化趨勢，可以進一步探究食用菌的營養生理，提高栽培技術。在食用菌胞外酶中，羥甲基纖維素酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、多酚氧化酶、半纖維素酶等均對食用菌生長起著很大的作用［2－8］，但其中最為主要的酶有羥甲基纖維素酶、淀粉酶、漆酶。所以下面將會對這幾種酶的測定方法進行主要分析。

1 漆酶

漆酶屬于多銅氧化酶家族中的一大類，利用分子氧通過自由基－催化反應機制來氧化各種芳香族和非芳香族化合物［9］，是一種糖蛋白。是與木質素等大分子物質降解有關的酚氧化酶，它能加速木質素芳香族化合物的分解，為菌絲提供營養。胞外漆酶活性越高菌株分解木質素能力就越強。目前測定漆酶酶活的方法有分光光度法、測O2法、高效液相色譜法、極譜法、脈沖激光光聲分析法、微量熱法等。其中最常用的方法為分光光度法，而在分光光度法中比較常用的有鄰聯甲苯胺法，ABTS法，愈創木酚法等。因為不同來源的漆酶與底物反應的親和力不同，即使同一來源的漆酶，底物不同，反應的親和力也不同，測得的酶活數值就不同。因而，目前也沒有統一的方法來測定漆酶酶活。以下總結了最常用的分光光度法中的幾種常見方法并進行了比較分析。

1.1 鄰聯甲苯胺法

鄰聯甲苯胺法測定漆酶酶活是以鄰聯甲苯胺為底物，以醋酸溶液反應體系為緩沖溶液，pH值為4.0或4.6，緩沖溶液的濃度有0.039、0.077、0.085 mol／L 3種。反應溫度可選擇在25、28、30、40℃，反應時間與反應溫度有關，30℃和40℃一般反應5min，25℃和28℃一般反應30min，分光光度計波長一般在600nm。鄰聯甲苯胺容易購買且價格相對ABTS便宜，可選擇的反應溫度多，在30和40℃時反應時間短，但鄰聯甲苯胺毒性較強，且該底物水溶性差，所以測定的酶活力低。

1.2 ABTS法

ABTS法是最常用和使用最廣泛的漆酶酶活測定方法。其酶活反應的底物為ABTS（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸），ABTS經漆酶作用后形成ABTS自由基，ABTS的濃度在0.1～5mmol／L，常用0.5mmol／L反應的緩沖體系為醋酸溶液反應體系，pH值一般在4.0～5.0，常用pH值為5.0，反應一般在室溫下（25℃）進行，但有時為了防止過氧化氫［10］的影響也會選擇在較高溫度下反應。分光光度計的波長一般為420nm［11－12］，也有報導用波長為436nm［13］測吸光度。

雖然ABTS市場價格較高，但漆酶對ABTS的親和力強，反應催化能力高，ABTS為底物測漆酶活性反應靈敏度高，因為ABTS是直接測定產生的ABTS陽離子自由基，ABTS離子自由基在水溶液中比較穩定所以測出的OD值也精確，因此該方法為測定漆酶酶活較實用、較精確的方法。

1.3 愈創木酚法

反應底物為愈創木酚，底物的3種常用終濃度為0.4、0.8、1.0mmol／L。緩沖溶液常用琥珀酸鈉溶液，pH 值一般為4.5，濃度為0.05mol／L，也有用磷酸鈉緩沖溶液的。反應一般在30℃下反應30min，分光光度計波長為465nm［17］。

漆酶在作用于愈創木酚時產生的物質由于不穩定可轉化為多種形式，有醌類物質、聚合物和C－O，C－C偶聯產物［14－16］，由于只是在某波長下測定產物醌類物質的數量來計算酶活，所以最后測定的酶活不準確（偏低）。醌類物質的量不確定，酶活測定也存在不穩定性，且此種方法反應時間過長。

根據國外的文獻報道，常用ABTS法或丁香醛連氮法測定漆酶酶活，國內常用ABTS法、愈創木酚法和鄰聯甲苯胺法測定漆酶。

2 羥甲基纖維素酶

纖維素酶是一種復合酶，由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶構成［18］。因此測定纖維素酶活的方法可分為纖維素酶總酶活力測定與單一纖維素酶組分的測定。對于單一纖維素酶組分的測定方法，其中以羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測定方法最為常見［19］。

在測定纖維素酶總酶活力時，可選擇的底物是多種多樣的，有熒光定糖法、濾紙酶活（FPA）測定法等多種方法。即使這樣，現代測定纖維素的方法已基本明確。下面將會介紹幾種常用的測定纖維素酶酶活的方法。

2.1 濾紙酶活（FPA）測定法［20］

此方法以纖維素酶作用于濾紙后生成的還原糖量來表征纖維素酶的糖化能力。很多文獻報道該方法在pH值為4.6的醋酸緩沖溶液中，與1條lcm×6cm新華濾紙（50±1 mg）在50℃下反應60min，DNS顯色5min，于520nm處測定OD值，也有報道稱是在530nm處測定OD值［21］。此方法較為穩定，是一種公認的、經典的方法。但此種方法由于其底物濾紙是不溶性的，結構比較復雜，且影響因素較多，耗時較長［22］，所以大部分實驗室對其進行了改良。此方法更適于高酶活的樣品。

2.2 羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測定方法［20］

纖維素酶作用于CMC－Na，使其降解，生成纖維二糖、葡萄糖等還原糖，在堿性條件下能將3，5－二硝基水楊酸（DNS）還原，生成棕紅色的氨基化合物，用標準葡萄糖溶液作標準液，22PC分光光度計在520nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當于1μmol的葡萄糖為一個酶活性單位［23］，在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。反應應在pH值為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖液中進行，于50℃水浴鍋中反應5min，加入DNS沸水浴反應5min后測定OD值。生成棕紅色的氨基化合物。以羧甲基纖維素為底物測得的酶活值比以濾紙為底物測得的酶活值高，這說明酶對水溶性底物有較高的活力，同時也表明，吸附對酶的活性部位與纖維素分子鏈段的結合及催化均有很大影響［21］。于是，干寧、徐偉民等提出了用SiO2凝膠包埋葡萄糖氧化酶（GOD）電化學傳感器（GOD／SiO2）測定羥甲基纖維素酶活性的方法，此方法用SiO2包埋葡萄糖氧化酶，使其生物活性不被破壞且分布均勻。此種方法操作簡單、靈敏度高［19］。

2.3 熒光定糖法［24］

熒光定糖法是通過測定生成的還原糖與反應液生成熒光物的熒光強度來表征纖維素酶的酶活力。據報道稱熒光定糖法測定纖維素酶活力的最佳背景體系 為 46.7mg／g 乙醇胺 ＋46.7mg／g 硼酸 ＋50mmol／L檸檬酸，反應體系為以46.7mg／g乙醇胺＋46.7mg／g硼酸＋50mmol／L檸檬酸＋20μg葡萄糖，反應時間為10min，反應溫度為150℃。此種方法簡單快速，專一性強，具有較高靈敏度，適于纖維素酶活力的大量樣品的測定，但此方法更適于低濃度纖維素酶活力的測定。

3 淀粉酶

淀粉酶是α－淀粉酶、β－淀粉酶及葡糖淀粉酶的總稱，一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等α－1，4－葡聚糖，水解α－1，4－糖苷鍵的酶。根據酶水解產物異構類型的不同可分為α－淀粉酶與β－淀粉酶。微生物中主要的兩種淀粉酶為α－淀粉酶及葡糖淀粉酶。測定淀粉酶的方法有很多種，如碘－淀粉比色法、3，5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）等。

3.1 碘－淀粉比色法

淀粉經α－淀粉酶催化水解，生成產物為葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物淀粉濃度已知且過量的條件下，反應后加入碘液與末被催化水解的淀粉結合成藍色復合物。將其藍色的深淺與未經酶促反應的空白管比較，從而計算出淀粉的量，推算出淀粉酶的酶活力。此反應應在pH值為7.0、酶底物淀粉濃度為0.4g／L的緩沖液的體系中進行，在40℃下和底物淀粉作用30min，于660nm波長處測定吸光度值［25］。碘－淀粉比色法測淀粉酶活力具有操作簡便迅速、實用等優點，但此方法也有重復性差，準確率低等缺點［26］。

3.2 3，5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）［27］

此法是用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量來表征淀粉酶的酶活力。反應是在pH值為5.6的檸檬酸緩沖液中進行，取檸檬酸淀粉緩沖液與淀粉酶混勻，于60℃水浴中保溫30min，將酶液與顯色劑DNS于40℃水浴中5min，于520 nm波長下測吸光度值，然后計算酶活力。在DNS比色法中，所用試劑易得，溶液有效期長，精確度高，結果較為穩定可靠都是此方法的優點，但相對于碘－淀粉比色法它的操作則較為復雜。

4 小結與展望

隨著人們對食用菌胞外酶研究的不斷深入，測定酶活的方法也越來越多。但因各種測定方法均各有利弊，所以我們需要根據不同的情況，來具體討論采用何種方法測定酶活。不同的酶活力測定方法，因反應機制不同，反應時間不同，同種酶活性不同，導致不同研究者和不同文獻中對同一種酶的酶活測定也無法進行分析比較。因此，將各種酶活力測定方法進行歸納整理很有必要，可以讓研究者有一個更有價值和科學的方法來分析比較。但無論方法怎樣多變，各種酶活的測定方法都將會朝著操作簡便、快捷、高靈敏度方向發展。

綜上所述，自胞外酶被人們研究利用以來，其各種酶的酶活測定方法就不斷涌出，但自動化測定酶活的方法還是占據了小部分，隨著科技的進步，復雜繁瑣的人工測定酶活的方法終將會被簡便的自動化方法所取代。精密儀器的使用也會越來越普遍。更好的測定方法會使得測定出的數據結果更加準確可靠，使得科學研究、應用生產等工作更加順利的進行。

［1］ 倪新江，丁立孝，馮志勇，等.灰樹花生長發育過程中的幾種胞外酶活性變化［J］.微生物雜志，2001，21（3）：24－25.

［2］ 李守勉，李明，田景花，等.八個杏鮑菇菌株胞外酶活性及蛋白質含量的研究比較［J］.食用菌，2007（6）：11－12.

［3］ 張國利，田雪梅，宋愛榮.八個樟芝菌株液體培養兩種胞外酶活性的測定［J］.中國食用菌，2009，28（2）：43－45.

［4］ 胡開輝，陳體強，黃志龍.巴西蘑菇不同菌株胞外酶活性的測定與分析［J］.江西農業大學學報，2000，22（5）：97－99.

［5］ 周長青，王秀峰，李玉.白靈菇生長發育過程中胞外酶活性的變化規律［J］.食用菌學報，2008，15（2）：64－68.

［6］ 朱啟忠.側耳792幾種胞外酶活性的測定比較［J］.食用菌，2006（5）：7－8.

［7］ 韓增華，張丕奇，孔祥輝，等.黑木耳胞外酶活變化與栽培性狀比較的研究［J］.食用菌學報，2007，14（4）：41－46.

［8］ 韓增華，張介馳，張丕奇，等.黑木耳原種胞外酶活性的研究［J］.生物技術，2009，19（5）：14－16.

［9］ Strong，P.＆Claus，H.Laccase：A Review of Its Past and Its Future in Bioremediation［J］.CritRev Sci Tec，2011，41（4）：373－434.

［10］ FukudaT，UchidaH，Takashima Y，et al Degradation ofbispheno－la by purified laccase from Trametes villosa［J］.Bioch Biophy ResCommu，2001，284（3）：704－706.

［11］ NiladeviK N，Sukumaran R K，JacobN，et al Optimization of lac－case production from a novel strain：Streptomycesp sammoticus using response surface methodo logy［J］.M icrob Res，2009，164（1）：105－117.

［12］ Pazarlioglu N K，Sariisik M，Telefoncu A.Laccase：production by T rametes versicolor and application to denim washing［J］.Proc B ioch，2005，40（5）：1673－1678.

［13］ Galhaup C，W agnerH，H interstoisser B，et al Increased production of laccase by the wood－degrading basidiomycete T rametes pubescens［J］.Enzym M icrob Tech，2002，30（4）：529－536.

［14］ M inussiR C，Pastore G M，Duran N.Potential applications of laccase in the food industry［J］.T rends Food Sci Tech，2002，13（6／7）：205－216.

［15］ 韓君莉，郭麗瓊，林俊芳.漆酶結構的研究進展［J］.生物加工過程，2006，4（4）：1－6.

［16］ 堵國成，趙政，陳堅.真菌漆酶的酶活測定及其在織物染料生物脫色中的應用［J］.江南大學學報：自然科學版，2003，2（1）：83－86.

［17］ 王劍鋒，蘇國成，劉建玲，等.煙管菌漆酶合成的營養條件研究［J］.食品與發酵 工業，2006，32（2）：20－24.

［18］ 程抒劼，鄭蘭娟，林俊芳，等.纖維素酶活力測定研究進展［J］.食品工業科技，2009，30（7）：334－336，342.

［19］ 鄒劍.纖維素酶活性檢測方法簡析［J］.吉林農業，2011（7）：156.

［20］ 趙玉萍，楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較［J］.食品研究與開發，2006，27（3）：116－118.

［21］ 張瑞萍.纖維素酶活力測定方法［J］.印染，2002（8）：38－39.

［22］ 李亮亮，牛森.纖維素酶活力測定方法的比較研究［J］.遼寧農業科學，2001（4）：16－18.

［23］ 林祥木，童金秀，陳漢清，等.產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件的選擇［Ｊ］.福建農林大學學報（自然科學版），2003，32（4）：510－513.

［24］ 李亮亮，牛森，劉文娥，等.熒光定糖法測定纖維素酶活力的條件研究［J］.沈陽農業大學學報，2004，35（1）：59－61.

［25］ 曾東方，楊帆，聶歡歡.DNS法對食用菌發酵液淀粉酶活力的測定［J］.現代農 業科技，2011（11）：16－18.

［26］ 劉兆軍，吳紅光.蛋白對碘－粉比色法測定血清淀粉酶的干擾及排除［J］.現代檢驗醫學雜志，2002，17（2）：45－46.

［27］ 白燕，王維新.刺參腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶與纖維素酶活性的測定方法［J］.飼料工業，2012，33（20）：28－32.