qPCR和電泳對siRNA轉染效率鑒定分析

馮軍軍

（ 山西大醫院檢驗科，山西 太原 030030）

qPCR和電泳對siRNA轉染效率鑒定分析

馮軍軍

（ 山西大醫院檢驗科，山西 太原 030030）

RNA 干擾（RNAi）技術是近些年快速發展并被越來越多人逐漸越發重視的一項基于轉錄水平上的基因阻斷技術，具有序列特異性、時效性、高效性和易操作性等諸多優點，而研究結果證實，siRNA 即小分子干擾 RNA 是 RNAi最主要的作用因子。本文分別介紹了qPCR 和電泳兩種對 siRNA 轉染效率的鑒定方法，以供參考。

qPCR；電泳；siRNA 轉染效率；鑒定

據統計，最有效的siRNA 抑制靶基因表達效率超過90%，好的鑒定方法甚至可將表達效率提升至99%，如此對于基因治療而言，siRNA可作為基因組功能研究的有力工具，而且脂質體在所有已用于臨床試驗的基因載體中僅次于病毒載體，是最有發展前景的非病毒載體[1-3]。為此，本文分別介紹了qPCR和電泳兩種對siRNA轉染效率準確、方便、高校的鑒定方法，具體如下。

1 qPCR法

siRNA是定量檢測是RNAi抗病毒效果的關鍵，而當前RNAi作為特異抗病毒治療的熱點，因此為檢測抗CSFV特異siRNA分子，即siN1和siN2在細胞中的表達水平，必須構建篩選具有高特異性和靈敏度的siRNA特異莖環引物，而RT-qPCR及為siRNA的最優檢測方法，其可較好地表現出特異性和靈敏度，可檢測出101-108個復制的siRNA，檢測范圍亦達到7個數量級之多，而且其平行性較好（RSQ=0.999），擴增效率也較高達到了98.3%。具體操作方法如下。

1.1 RNA提取

將抗CSFV的PK-15 細胞克隆，并培養在6孔細胞培養皿中，待其滿度達到90%-95%之間時，可將培養液棄掉，改用1mL PBS在冰上將細胞清洗兩次，然后根據說明書的要求加入500μL的裂解液，在提取其總的RNA，并將PK-15細胞作為陰性對照。同時，再用NanoDrop1000測量RNA的質量和濃度，并將它們裝在-80℃的環境下保存。

1.2 逆轉錄反應

逆轉錄反應包括50 mmol/L莖環引物，0.25 mmol/LdNTPs，3.33 U/μL逆轉錄酶，0.25U/μL RNA酶抑制劑，等倍的逆轉錄緩沖液，10mg總RNA，用無RNA酶水補至15μL。其反應的條件即冰上擱置5mins，15℃溫度下30mins，43℃下同樣30mins，直至85℃酶滅活5mins，最后擱置4℃將其保存。

1.3 實時定量PCR反應

該體系為10μLPCR預混液，1.5μmol/L上游引物0.7μmol/L通用下游引物，0.2μmol/L MGB探針，1.2μLcDNA 產物，去離子水補至20μL。再在實時定量PCR儀上進行反應，條件為95℃下變性15s，熱啟動10mins，再轉成60℃退火60s，收集熒光，反復循環40次。需注意的是，所有陰性細胞對照和空白對照都須充分兩遍，再去均值。

1.4 靈敏度和特異性分析

根據RT-qPCR檢測繪制標準曲線，計算細胞表達的siRNA 拷貝數，并分析此方法檢測靈敏度。在將與siRNA大小相似的內源性miRNA作為特異性分析材料，選擇PK-N1、PK-N2 和PK-siC 細胞克隆和陰性細胞PK-15和PFF的總RNA胃模板進行siRNA的RT-qPCR檢測，進而評價檢測的特異性。

2 電泳法

2.1 配置熒光染料

將SYBR Gold熒光染料用TBE緩沖液稀釋10000倍，取5μmol/ LsiRNA 溶液，吸取0；2；4；5；8；10μL分別注入聚乙烯離心管中，同時相應地加入19；18；16；15；2；10μL的緩沖液，待充分融合后制成相應的siRNA標準溶液，再在各管中加入50%蔗糖-溴酚蘭溶液5μL，待進行渦旋離心后將上述溶液分別加入20%聚丙烯酰胺凝膠5μL，然后在100V電壓下電泳2小時，待凝膠放入SYBR Gold熒光染料中染色20mins后在凝膠成像系統中觀察siRNA 條帶并拍照。

2.2 回收率實驗

回收率實驗可按照以下步驟進行，即①取空白脂質體膠體溶液10μL，并分別加入高、中、低3中不同濃度的siRNA 標準溶液各5μL靜置15mins；②加入0.1 mol/LTritonX-100溶液和0.1%肝素溶液各2μL，使siRNA 從陽離子脂質體中完全釋放；③加入RNA提取試劑即按照氯仿∶苯酚∶異戊醇=25∶24∶1比值制成的混合溶液25μL，靜置15mins后，再在4℃條件下離心20mins；④收集含有siRNA的水相部分，加入上樣緩沖液6μL，待充分混合后再取5μL混合物加入凝膠加樣孔中，根據凝膠電泳的程序觀察siRNA；⑤根據標準曲線方程算出siRNA的濃度，進而計算回收率。

2.3 精密度實驗

根據“標準曲線的繪制”項進行操作，在5日內測定高、中、低3 種濃度的siRNA含量，并計算其精密度，對此亦可以進行陽離子脂質體中siRNA 的含量測定，即精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液10μL，再按上述操作方法，求出siRNA的濃度值。

2.4 載基因陽離子脂質體包封率測定

siRNA會有兩部分，一部分被陽離子脂質體包裹，存在凝膠孔中，另一部分處于游離狀態，而這部分游離的siRNA經過電泳后會在凝膠中形成條帶，即致使siRNA和載基因脂質體分離。再精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液15μL，再加入上樣緩沖液5μL，將二者充分混合，再取混合溶液5μL加入到凝膠孔中，待電泳過程完備后，觀察游離部分的siRNA條帶情況，同時按照標準曲線計算游離siRNA濃度C1，再精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液10μL，根據含量測定相應方法計算陽離子脂質中的siRNA總濃度C，如此即可得到包封率（被包裹物質（如某藥物）在脂質體懸液中占藥物總量的百分量）=（C-C1）/C × 100%。

3 兩種方法對siRNA轉染效率的鑒定結果

3.1 電泳法鑒定結果

通 過 對 脂 質 中 siRNA含 量 的 測 量 ， 檢 測 其 線 性 范 圍 為0.2～2.0μmol/L，其中R=0.9931，另高中低三種溶液濃度分別為96.36%，96.93%和100.75%，其中n=3，另5日內和日間的精密度RSD均＜5%，符合方法學要求。

3.2 qPCR法鑒定結果

通過qPCR法對siRNA轉染效率的鑒定結果表明，高、中、低3 種濃度的回收率在95.1%～101.2%之間，且RSD的精密度均＜2.0%，符合方法學要求。

4 討 論

4.1 電泳法

計算機技術的快速發展和應用使得對電泳圖譜的分析更加科學化和精確化，比如ImageJ即是一種可對圖像面積、重心、平均密度以及多邊形區域進行分析的圖像分析程序，它可以自動對圖像進行點的分析、以及測定路徑長度和角度等諸多功能。實踐證明，采用ImageJ分析電泳圖譜靈敏度較高、重復效果好，劑量-密度/亮度的線性關系明顯，而且操作簡單、取樣量少、分析快速精確等諸多優點，因此可有效提高工作人員的工作效率。

4.2 qPCR法

本文所闡述的RT-qPCR法，可較準確的定量檢測細胞抗病毒siRNA 的表達水平，例如在抗豬瘟病毒轉基因動物的構建中，它可有效提高你抗病毒轉基因動物的成功率，并未將來轉基因動物的抗病毒效果評價提供有力參考，不僅如此，此法對siRNA 、miRNA等小RNA的檢測工作亦具有很好的參考價值。

5 總 結

電泳法和qPCR法均可準確、可靠、穩定地對siRNA轉染效率進行鑒定，且其穩定性高，操作方便簡單，可有效用于陽離子脂質體中siRNA的含量檢測。值得注意的是，在電泳法中，要想讓siRNA 從陽離子材料中釋放，必須加入去縮合劑。在實際應用中，工作人員需結合具體實際選擇性操作。

[1]柴翠翠,單麗輝,齊蕾,等.siRNA反向轉染法提高原代癌相關纖維母細胞轉染效率的研究[J].山東醫藥,2012,52(24):34-36.

[2]劉帥,李江南,袁婷,等.莖環法RT-qPCR定量檢測細胞抗豬瘟病毒siRNA的表達[J].動物及獸醫生物技術,2012,28(1):26-36.

[3]沈雁,涂家生,龐卉,等.凝膠電泳法及熒光光度法測定siRNA陽離子脂質體的含量和包封率[J].藥學學報,2009,44(4):430-435.

R446.6

：A

：1671-8194（2013）03-0398-02