乙型肝炎病毒基因分型方法的研究進(jìn)展

倪曉艷 曹 文

（遼寧省東港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 東港 118300）

乙型肝炎病毒基因分型方法的研究進(jìn)展

倪曉艷 曹 文

（遼寧省東港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 東港 118300）

目的 為建立一種快速、直接、簡單以及經(jīng)濟(jì)的乙型肝炎病毒基因分型的方法，并且能夠便于大批量的標(biāo)本檢測。方法 從前S1基因到S基因中的序列設(shè)計(jì)出10條內(nèi)外引物，并將其中4條內(nèi)引物擴(kuò)增A B C 型乙型肝炎病毒，然后將第2 輪PCR的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像分析系統(tǒng)所顯示的PCR產(chǎn)物片斷大小直接判定HBV基因型。結(jié)果 本文應(yīng)用乙型肝炎病毒PCR分型方法，結(jié)果可靠。檢測以基因C型為主，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，200例HBV DNA基因分型：B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），兩例基因型不明。重復(fù)性試驗(yàn)：基因分型鑒定結(jié)果前后符合率為100%。結(jié)論 我們采用型特異性引物經(jīng)兩輪PCR分別擴(kuò)增A-C型HBV，從PCR 產(chǎn)物片段的大小即可直接判定HBV 基因型，此方法特異性高，簡單，容易操作等。

乙型肝炎病毒基因；基因型；PCR擴(kuò)增

HBV在漫長的歲月中累計(jì)的點(diǎn)突變構(gòu)成不同的基因型，基因型的提出為HBV的研究開辟了新的領(lǐng)域[1]。本實(shí)驗(yàn)采用型特異性引物PCR擴(kuò)增法對(duì)200例江浙滬地區(qū)乙型病毒性肝炎患者進(jìn)行了HBV基因分型，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)所得圖像進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本血清

收集2009年3月至2009年4月杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心PCR科室篩選的乙型肝炎病毒陽性的標(biāo)本200例（此標(biāo)本由羅氏LightingCycler480高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測出HBV DNA＞1×103copy/ml）。

1.1.2 基因提取、擴(kuò)增和電泳主要試劑

血清DNA提取所用試劑購自上海克隆生物高技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)體系由迪安科研部自備，其中Taq酶與MgCl2購自Fermentas公司，dNTP則購自Keygene公司；引物由上海英駿（invitrogen）生物技術(shù)有限公司合成，瓊脂糖購自北京凌峰源生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

HB-100恒溫金屬浴儀為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品，PCR儀為杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的LongGene-MG96G型，離心機(jī)為貝克曼（BeckMan）公司的Microfuge I6，電泳儀為上海復(fù)生生物工程研究所生產(chǎn)的FS-600，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀為上海培清科技有限公司生產(chǎn)的JS-380C。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本準(zhǔn)備

杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中PCR科室的對(duì)常規(guī)血清標(biāo)本用羅氏LightingCycler高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測，檢測陽性標(biāo)本送科研室進(jìn)行乙型肝炎病毒分型實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 血清DNA模板提取

按照試劑盒說明書進(jìn)行，主要步驟為：取50μL待測血清樣本加入50μL核酸提取液A，振蕩混勻10min，12000rpm離心10min，棄去上清；再加入50μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10s，100℃金屬浴10min，12000rpm離心2 min，取2μL上清液作為模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR 按Naitoetal[2]方法進(jìn)行稍作改動(dòng)。首先用一對(duì)外引物（P1、Ps）進(jìn)行第1輪PCR，在0.2mLPCR管中依次加入通用引物P1（10 μmol/L）0.8μL，Ps（10μmol/L）0.8μL，dNTP（10mM）0.8μLTaq 聚合酶（1μ/mL） 0.4μL，10×PCR 緩沖液（含20 mM Mg2+） 2.5μL，血清DNA提取物1μL。擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性5min，94°C 變性60s，55°C退火45s ，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)后72°C再延伸5 min。然后分別以B2、BA1R、BB1R、BC1R為內(nèi)引物進(jìn)行第2 輪PCR，分別檢測A型、B型和C型乙型肝炎病毒。第二輪乙型肝炎病毒PCR 反應(yīng)體系中除引物外的其余成分同第1輪PCR，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性10min ，94°C變性20s，58°C退火20s，72 °C延伸30s，40個(gè)循環(huán)后72°C再延伸10min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳及數(shù)據(jù)分析

用微量加樣器將DL2000 marker 5μL、PCR產(chǎn)物8μL及陰性對(duì)照和空白對(duì)照分別加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳。

2 結(jié) 果

用特異性引物可分出乙型肝炎病毒 DNA片斷分別為281bp和122bp的HBV DNA B型和C型，，同時(shí)出現(xiàn)281bp和122bp條帶者為BC混合型。

2.1 200例HBV DNA基因分型

B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），兩例基因型不明。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

200份患者血清中隨機(jī)挑選20份，多次應(yīng)用方法分型，基因分型鑒定結(jié)果前后符合率為100%。

3 討 論

HBV 基因型與乙肝的傳染性、臨床疾病預(yù)后判斷及抗病毒藥物治療的選擇具有一定的相關(guān)性，因此對(duì)HBV基因型的檢測意義重大。目前現(xiàn)有的分型方法尚有些許不足如直接測序法相對(duì)最為準(zhǔn)確，但測序時(shí)間長、成本高、需反復(fù)比較分析才能得出結(jié)論，無法進(jìn)行大樣本量的流行病學(xué)研究[3]；一般的PCR-RFLP分型法大多也是擴(kuò)增后再測序比直接測序法也只稍微節(jié)省成本，而且此法所需時(shí)間較長，步驟多，混合感染或酶切不完全時(shí)出現(xiàn)復(fù)雜條帶，結(jié)果難以判斷[4]。微板核酸雜交ELISA 法雖然特異性較高，但雜交后需復(fù)雜的顯色步驟，雜交背景也很容易受各種因素的干擾。

本研究采用型特異性引物PCR擴(kuò)增法進(jìn)行基因分型，在嚴(yán)格的PCR條件下根據(jù)產(chǎn)物片斷的大小判斷基因型別方法較為簡便快速，特異型高，檢測費(fèi)用較低。但由于有些樣本的HBV濃度較低或其他原因使結(jié)果呈假陰性而導(dǎo)致無法分型或會(huì)出現(xiàn)較復(fù)雜的帶型從而不利于結(jié)果判斷，尤其當(dāng)同一標(biāo)本混有兩種基因型時(shí)更無能為力，另外由于HBV基因變異的多樣性，巢氏PCR分型法不能鑒定100%的樣品。今后還需進(jìn)行更多的臨床研究和實(shí)驗(yàn)。

總之應(yīng)用型特異性引物PCR方法進(jìn)行HBV基因型檢測，方便，準(zhǔn)確，成本低，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

[1] 陳鐘先,齊舒,方勇.湖北地區(qū)乙型肝炎病毒基因型分布與臨床的相關(guān)性[J].中華肝臟病雜志,2006,25(2):214-217.

[2] De Castro L,Araujo NM,Sabino RR,et al.Nosocomial spread of hepatitis B virus in two hemodialysis units,investigated by restriction fragment length polymorphism analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis ,2000,19(7):531-537.

[3] OkamotoH, Tsuda F, TanakaT,et al.Typing hepatitisB virusby ho-mology in nucleotide sequence: comparison of surface subtype[J]. J Gen Virol,1988,69(10):2575-2583.

[4] 楊勝得,何秉賢.乙型肝炎病毒基因型及臨床意義[J].中華傳染病雜志,2001,29(3):187.

R512.6+2

B

1671-8194（2013）01-0077-02