K－Ras與B－Raf在前列腺癌組織表達及其與預后的關系

王朝暉，李玉中，宋麗媛

（大連醫科大學附屬第二醫院1.實驗中心；2.檢驗科；3.病理科，遼寧 大連116027）

隨著人口老齡化程度的加劇及人們生活條件的改善，前列腺癌的發病率逐年增長，躍居男性泌尿、生殖系統惡性腫瘤的第三位。近年來分子靶向藥物酪氨酸激酶受體抑制劑TKI（tyrosine kinase inhibitor）在臨床上已廣泛應用。該藥的作用機制通過抑制EGFR（epidermal growth factor receptor）酪氨酸磷酸化，阻止 EGFR－Ras－Raf－MEK－ERK 信號轉導通路的啟動，抑制腫瘤細胞生長。研究K－Ras和BRaf在前列腺癌組織的表達，旨在探討其與前列腺癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集大連醫科大學附屬第二臨床學院2010年1－12月手術切除的前列腺癌病理組織蠟塊74例，74例癌癥患者中年齡34－92歲，平均年齡（58.00±13.51）歲。標本按2002年 WHO腫瘤國際組織學分類標準分類：其中高中分化癌23例，低分化癌51例；按Whitmore－Jewett（ABCD）系統標準進行臨床分期：其中（A＋B）期40例，為未浸潤轉移組；（C＋D）期34例，為浸潤轉移組。前列腺增生39例，患者年齡40－87歲，平均年齡（62.34±14.37）歲。所有患者術前均未進行放、化療和生物治療。

1.2 方法

用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素過氧化物酶（SP）法檢測K－Ras和B－Raf蛋白在前列腺癌和增生組織中的表達。K－Ras和B－Raf單克隆抗體分別購自Ab－cam和Santa Cruz，使用濃度分別為1∶200和1∶400。SP試劑盒和二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑均購自北京中山生物技術有限公司。操作步驟按免疫組化試劑盒要求進行，組織切片在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中用微波抗原熱修復100℃10分鐘，用磷酸鹽緩沖液代替一抗做空白對照。

1.3 結果判斷

K－Ras和B－Raf在腫瘤細胞胞質中出現棕黃色為陽性細胞，無陽性細胞（－）；陽性細胞＜25%（＋）；25%≥陽性細胞＜50%（＋＋）；陽性細胞≥50%（＋＋＋）。（＋）以上為陽性表達。

1.4 統計學分析

應用SPSS 13.0統計軟件，兩組或多組計數資料采用χ2檢驗進行數據統計學分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 K－Ras在前列腺癌組織的表達

K－Ras在前列腺癌組織的表達（79.73%，49／74）明顯高于前列腺增生（23.08%，9／39），χ2＝19.025，P＜0.01。在高中分化和低分化的表達分別為 （65.22%，15／23）和 （66.67%，34／51），χ2＝0.15，P＞0.05；在未浸潤轉移（A＋B）期和浸潤轉移（C＋D）期 表 達 分 別 為 （60.00%，24／40）和（73.53%，25／34），χ2＝1.504，P＞0.05。

2.2 B－Raf在前列腺癌組織的表達

B－Raf在前列腺癌組織的表達（64.86%，48／74）明顯高于前列腺增生（10.26%，4／39），χ2＝30.659，P＜0.01。在高中分化與低分化表達分別為（43.48%，10／23）與 （74.51%，38／51），χ2＝6.698，P＜0.05，在（A＋B）期與（C＋D）期表達分別為 （42.50%，17／40）與 （91.18%，31／34），χ2＝19.107，P＜0.05。

2.3 K－Ras和B－Raf蛋白表達的相關性

K－Ras和 B－Raf蛋 白 表 達 呈 正 相 關，r2＝0.272，P＝0.019，P＜0.05。

3 討論

Ras／Raf／MAPK （mitogen－activated protein kinase）信號通路是細胞生物學中最具特征的通路，是膜受體信號向細胞內傳遞的重要途徑，該通路參與調節細胞生長、凋亡和重要基因的表達［1］。Ras是一種鳥核苷酸結合蛋白，具有內源性GTP酶活性，它包括K－Ras、N－Ras、H－Ras等，Ras編碼小GTP結合蛋白，參與很多細胞功能如細胞分化及蛋白運輸等。Ras／Raf／MAPK信號通路中的膜受體被一些生長因子激活后，進而激活Ras蛋白，活化的Ras－GTP直接與下游Raf的N端結構域結合并使其激活，活化的Raf又激活下游的MAPK，從而激活了MAPK級聯反應。Raf作為Ras下游的關鍵性蛋白之一，是絲氨酸／蘇氨酸激酶家族成員，亞型包括Raf、A－Raf和B－Raf。MAPK激活后可以激活多種核轉錄因子和激酶，進而影響基因轉錄和調節細胞功能，且當活力失控時會導致腫瘤［2，3］。

K－Ras在前列腺癌中的表達國內研究較少，本研究顯示前列腺癌組織的表達明顯高于前列腺增生，但其與腫瘤的分化程度和浸潤轉移差異無顯著性意義，說明K－Ras基因過表達在前列腺癌的發生中起一定促進作用。

B－Raf基因突變在甲狀腺癌發生發展中有其獨特而重要的作用［5，6］。目前國內在結直腸癌、惡性黑色素瘤及甲狀腺癌中研究較多，但在前列腺癌組織研究較少。Yuen［7］研究發現，結直腸癌中分化程度越低B－Raf蛋白表達越高，Houben［8］研究發現BRaf的突變狀態與惡性黑色素瘤的分期及預后呈正相關。本研究顯示，B－Raf蛋白在前列腺癌組織表達明顯高于前列腺增生，這說明B－Raf蛋白過表達與前列腺癌的發生有關。本研究還發現，B－Raf蛋白的過表達與前列腺癌的分化程度呈負相關，即分化程度越低B－Raf表達越高，與浸潤程度呈正相關，即預后越差B－Raf蛋白表達越高。與Yuen和Houben研究的其他腫瘤的表達規律基本一致，BRaf蛋白的過表達預示著前列腺癌的預后較差。

如果Ras／Raf／MAPK信號通路中的某一成員發生突變，就會引起通路下游效應蛋白的功能發生改變，通路保持持續激活狀態，必然會引起細胞異常增殖以及凋亡障礙等［4］。本研究發現，K－Ras與BRaf在前列腺癌的表達呈顯著正相關，說明二者在前列腺癌的發生中起協同作用。他們中的一個因子或多個因子過度表達，都會激活Ras／Raf／MAPK信號通路，從而參與前列腺癌的發生發展。

［1］Adjei AA.Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy［J］.Natl Cancer inst，2001，93：1062.

［2］Liemann C.Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signalling pathway：paradigms of multiplicity［J］.Cell Signal，2002，13：777.

［3］Avruch J，Khokhlatchev A，Kyriakis JM，et al.Ras cactivition of the Raf kinase：tyrosine recruitment of the MAP kinase cascade［J］.Recent Prog Horn Res，2001，56：127.

［4］Norman KL，Hirasawa K，Yang AD，et al.Reovirus oncolysis：the Ras／RalGEF／p38pathway dictates host cell permissiveness to reovirus infection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：11099.

［5］Mitsutake N，Knauf JA，Mitsutake S，et al.Conditinal－BRAFV600Eexpression induces DNA synthesis，apoptosis，dedifferentiation，and chromosomal instability in thyroid PCCL3cells［J］.Cancer Res，2005，65（6）：2465.

［6］Knauf JA，Ma X，Smith EP，et al.Targeted expression of BRAFV600Ein thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation［J］.Cancer Res，2005，65（10）：4238.

［7］Yuen ST，Davies H，Chan TL，et al.Similarity of the phenotypicpatterns associated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoclassic［J］.Cancer Res，2004，62（22）：6451.

［8］Houben R，Becker JC，Kappel A，et al.Constitutive activation of the Ras－Raf signaling pathway in metastatic melanoma is associated with poor prognosis［J］.Carcinog，2004，3（1）：6.