脂肪干細胞對創面愈合作用的研究進展

俞曉帆 綜述 熊 猛 審校

·綜述·

脂肪干細胞對創面愈合作用的研究進展

俞曉帆 綜述 熊 猛 審校

創面愈合是由多種細胞及細胞因子參與的復雜過程，難愈或不愈創面是整形外科的一大挑戰。隨著人們對脂肪干細胞基礎研究及臨床應用研究的深入，利用脂肪干細胞來提高創面愈合已被證明是一種非常有前景的治療策略。在此就脂肪干細胞促進創面愈合的機制、治療策略的改進、細胞移植途徑及臨床應用研究等方面的進展進行綜述。

脂肪干細胞創面愈合臨床應用

創面愈合是一個復雜的病理生理過程，大體可分為炎癥反應、肉芽組織形成、再上皮化及傷口愈合后塑形四個階段，是一個多種細胞參與的有序變化過程。目前，難愈或不愈創面的治療仍是整形外科的難題。利用組織工程技術，如干細胞療法，來提高創面愈合速度成為近年來的研究熱點。

脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是由Zuk等[1]從脂肪組織中獲取的多能干細胞，可向三個胚層的細胞分化，并可分泌多種細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、肝細胞生長因子（HGF）等。已有研究證實，脂肪干細胞具有促進上皮化、肉芽組織形成、血管重建等功能，對創面愈合具有積極作用[2]。

1 ADSCs促進創面愈合的機制

1.1 減輕炎癥反應

炎癥是機體對組織損傷或致病因子侵入的基本反應。其作用在于清除異物及自身傷亡的細胞、壞死組織，同時啟動分泌多種細胞因子誘導修復細胞的遷徙、增殖。但炎癥反應中激活和釋放的炎癥介質也可造成組織損傷，使創面愈合延期。董瑤等[3]將ADSCs注射入小鼠創面周圍，檢測到創面組織中促炎因子白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(TCP-1)表達下降，抗炎因子白細胞介素-10 (IL-10)表達上升，推測ADSCs促進皮膚創面的愈合機制可能與ADSCs降低創面局部的炎癥反應相關。

1.2 促進肉芽組織沉積

成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分。在傷口愈合過程中，成纖維細胞可遷移到傷口，并通過有絲分裂大量增殖，合成和分泌大量的膠原纖維和基質成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損。

獻報道ADSCs所分泌的細胞因子可加強成纖維細胞的增殖、遷移和分泌功能。Kim等[4]發現，ADSCs可通過細胞間直接接觸或細胞因子的旁分泌激活作用，促進人成纖維細胞增殖；而ASC-CM可通過上調Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白和下調MMP-1 mRNA的表達，促進成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白；在成纖維細胞的體外創傷模型中，發現ASC-CM可促進成纖維細胞向創面遷移。

Jung等[5]比較了TGF-β1與ASC-CM對創面愈合作用的異同。發現5 ng/mL TGF-β1組和50%ASC-CM組均可促進成纖維細胞中透明質酸合酶-1、透明質酸合酶-2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的表達，雖然表達量不同，但mRNA表達量增加和減少的時間點相似；在這兩組中加入等量抗TGF-β1抗體，上述mRNA的表達量均下降，并且與對照組的表達量無顯著性差異；蛋白質水平檢測結果顯示，兩組中透明質酸和Ⅰ型膠原蛋白分泌增加及減少的趨勢相同，并且Ⅰ型膠原蛋白的表達量相似。因此可以推斷TGF-β1是ASC-CM中一個重要的旁分泌介質，決定透明質酸及膠原的合成。

ADSCs不僅可通過旁分泌的方式促進成纖維細胞增殖、遷移及分泌蛋白，而且可以在體內微環境的作用下表達HSP47，向成纖維細胞分化，促進真皮層的重建[6]。

1.3 促進再上皮化

在創面愈合過程中，表皮角質細胞的遷移、增殖和分化形成新的表皮層，是覆蓋創面的必須過程之一，也是創面愈合的重要標志。趙京禹[7]在倒置顯微鏡下通過用200 μL槍頭在培養有表皮細胞的平皿底部刮擦，制備100 μm寬度的“表皮創面”模型，觀察到ADSCs可促進表皮細胞向創面中央遷移。移植ADSCs后的愈合組織進行免疫熒光染色，發現ADSCs在體內可表達CK19，表明ADSCs可在體內分化為表皮細胞，促進創面的再上皮化[6]。

1.4 促進血管重建

創面內新生血管的形成可以為創面提供氧、營養物質和生物活性蛋白，對創面修復具有重要作用。文獻報道，將ADSCs移植于局部創面，取愈合組織進行免疫熒光染色后發現，ADSCs可表達血管內皮細胞標記物（CD31）、血管性血友病因子（von Willebrand Factor）、平滑肌肌動蛋白（SMA），提示ADSCs在體內可分化為內皮細胞和血管平滑肌細胞，參與新生血管的構建；同時，檢測到ADSCs可在體內分泌VEGF、HGF，促進血管內皮的增殖和遷移，延長血管內皮細胞的壽命[2，8]。Altman等[8]證實了ADSCs可在體內新的微環境下向血管、上皮表型分化，可增加創面微血管密度，并促進血管充血。

1.5 促進創面收縮

肌成纖維細胞是由創面周圍的成纖維細胞在各種刺激因子的作用下轉變而來，是肉芽組織中的主要細胞成分。它不但保持了成纖維細胞的各種生理功能，而且具有平滑肌細胞的某些特點，與創面收縮有密切關系。Lee等[9]發現，ASCCM可促進成纖維細胞-膠原蛋白晶格復合物收縮，提示ASC-CM可誘導成纖維細胞表型向肌成纖維細胞轉變，從而促進創面的收縮。

2 優化ADSCs治療的方法

2.1 轉基因

將干細胞療法和基因療法相結合，可以使ADSCs分泌某些因子的能力大大提高。Rehman等[10]通過編碼VEGF的質粒轉染ACSs，使ADSCs分泌VEGF的量增加了200倍。王先成[11]采用EGF腺病毒載體轉染ADSCs，感染效率高達90%，檢測轉染后的ADSCs無染色體突變、生長曲線無明顯變化。進一步通過PCR檢測到了EGF基因的表達，ELISA檢測到了EGF蛋白的高分泌。

2.2 誘導分化后移植

因ADSCs在體內的分化效率不高，有研究將ADSCs在體外誘導分化后再移植入體內，以加快創面愈合。王先成[11]將轉染EGF基因的ADSCs體外誘導向表皮細胞分化，以表達角蛋白K19為誘導成功的標志，檢測其誘導效率約為43.3%。將誘導后的細胞移植于裸鼠創面，所形成的新生上皮厚且分層明顯，同時創面修復速度顯著加快；此外，新生表皮組織EGF的表達量也較轉基因未誘導ADSCs組顯著增多。

趙京禹[7]將含10%FBS的DMEM與30%鼠皮膚勻漿液配成條件培養基，誘導ADSCs向表皮細胞分化，發現誘導ADSCs分化后條件培養基組比單純EGF組CK19、CK14的陽性率高，差異有統計學意義。誘導前和誘導后3 d，處于S期的細胞所占的比例從30.29%提高至64.96%，表明細胞增殖速度加快，合成和代謝功能旺盛。他又采用另一種誘導方式，即將人表皮細胞與ADSCs間接共培養，檢測發現實驗組與對照組相比，ADSCs中CK19、CK14的陽性率高，差異有統計學意義。

2.3 與支架復合移植

2.3.1 Ⅰ型膠原

I型膠原由成纖維細胞所分泌，是細胞外基質的構成成分，廣泛存在于結締組織中。陸偉等[12]將ADSCs復合Ⅰ型膠原移植，可見大量成纖維細胞和微血管生長，光鏡下膠原纖維呈藍色，多且密集，與單純ADSCs相比有顯著差異。

2.3.2 纖維蛋白膠

纖維蛋白膠具有優良的生物相容性和體內可降解性，是組織工程領域應用較為廣泛的一種支架材料。其網絡狀結構不僅為細胞的代謝、細胞的增殖移行提供場所和支架，而且它的許多成分，如纖維蛋白原和纖維連接素等，可以作為暫時性的細胞外基質，誘導和促進組織的再生。劉世宇等[13]將ADSCs復合纖維蛋白膠移植于小鼠創面，與單純纖維蛋白膠移植相比上皮形成更好，膠原排列更有序，同時創區存在大量成纖維細胞。

2.3.3 透明質酸

透明質酸是細胞外基質的重要成分，可以促進細胞的遷移和增殖，并且參與一些細胞表面受體的相互作用。楊超等[14]制作放射性復合損傷模型，在損傷創面上滴加ADSCs-HA復合物以觀察創面愈合情況。結果顯示，在創面血管新生方面，ADSCs-HA復合物組新生微血管數量明顯較HA組和空白對照組豐富，而HA組優于空白對照組，說明單純HA對創面血管再生有促進作用，ADSCs-HA復合物促進血管新生的作用更顯著。

2.3.4 絲素殼聚糖

殼聚糖具有低免疫原性、抗菌、易塑性和形成多孔結構的特點，有利于細胞在其內生長。但殼聚糖的細胞親和性不高，細胞黏附性欠佳，絲素可以促進細胞的粘附和增殖，與殼聚糖起到互補的作用[15]。Altman等[8]將GFP標記的ACSs種植于絲素殼聚糖支架上，再將支架縫合于無胸腺小鼠全層皮膚缺損上。結果顯示，ADSCs-SFCS組較對照組傷口的愈合速度顯著提高。

2.3.5 人脫細胞羊膜

羊膜位于胎膜的最里層，是一種半透明膜。羊膜的許多特性使其能成為外科生物材料，如促進上皮再生、抑制纖維化、抗炎及抗血管生成特性、抗菌及抗病毒特性、高滲透壓性、低免疫原性等。

馬繼中[16]將取自健康足月剖腹產產婦的羊膜進行脫細胞處理后，將ADSCs種植于其上，再將ADSCs復合人脫細胞基質羊膜縫合于創面上，發現創面愈合速度顯著增加。

鞠曉軍等[17]觀察發現，人脫細胞羊膜兩面具有不同的三維結構，上皮面為較致密的網狀纖維，基質面為較稀疏的膠原纖維，未見纖維發生融合、斷裂和降解。ADSCs-HAAM復合培養3 d后掃描電鏡下可見細胞生長狀態良好，胞體肥大呈梭形隆起，胞膜外絨毛致密略有彎曲，胞體下方形成豐富的偽足牢固黏附于HAAM上。檢測ADSCs-HAAM組CK19表達明顯高于對照組，創面愈合速度亦顯著增加。

2.3.6 人脫細胞真皮基質

人脫細胞真皮基質因其具有無免疫原性、機械強度大及易操作等特點，在整形外科已經被廣泛應用。Altman等[6]將脫細胞真皮基質作為運輸ADSCs的載體，將ADSCs移植到小鼠的軟組織缺損上，結果顯示創面愈合加快。

2.4 在缺氧條件下培養

研究表明，ADSCs在體內有向缺氧組織遷移的能力。實驗證實，ADSCs在缺氧條件下培養，增殖加快并分泌更多的細胞因子。Rehman等[10]發現，每106個ADSCs可分泌（1203± 254）pg血管內皮生長因子（VEGF），當ADSCs在缺氧條件下培養時，VEGF的分泌量提高5倍。從缺氧ADSCs獲取的條件培養基可以顯著提高內皮細胞的生長，并且減少內皮細胞的凋亡。

Lee等[18]將ADSCs在常氧和缺氧條件下培養，獲得常氧和缺氧條件培養基hypoCM、norCM，發現缺氧條件下培養的ADSCs可以更好地生存及增殖；hypoCM可顯著提高真皮成纖維細胞分泌I型膠原及遷移的能力；將CM涂抹于創面表面，hypoCM可顯著促進創面的愈合；培養于缺氧環境的ADSCs可表達更多的VEGF及bFGF mRNA；另外，hypoCM中有更多VEGF及bFGF蛋白。

Moon等[19]證實，ADSCs的缺氧培養基可以在一定濃度范圍內，通過RhoA-ROCK通路刺激應力纖維形成，從而促進角朊細胞的增殖、遷移；2-D凝膠分析及抗體陣列證實缺氧培養基中含有48種蛋白以及HGF、FGF-1、G-CSF、GMCSF、IL-6、VEGF和TGF-β3等細胞因子。其中，HGF可以刺激中性粒細胞、單核細胞和肥大細胞向創面遷移[20]，并且促進前血管生成因子的分泌[21]。IL-6可以促進角化細胞的遷移及增殖[22]。GM-CSF在創面愈合過程的炎癥反應中發揮重要作用，可以提高創面中性粒細胞的功能[23]。此外，GM-CSF可促進角化細胞增殖，從而提高了上皮化。TGF-β3可以通過促進角化細胞遷移來加快創面愈合。VEGF促進血管內皮細胞的增殖和遷移，延長血管內皮細胞的壽命。FGF可促進血管內皮細胞的增殖，加快新生血管的長入。

3ADSCs移植途徑與全身分布情況

Suga等[24]將ADSCs通過三種途徑，即靜脈注射、腹腔內注射、皮下注射移植入小鼠體內，結果發現不論是何種途徑，細胞均能遷移至腦、心、肝、肺、網膜脂肪等組織器官內。并且測得采用腹腔內注射的細胞途徑，細胞遷移至各臟器后占臟器總細胞的比例為：肺36.95‰，脾15.7‰，腎、腦、肝均為4‰左右，其次為胰腺、心臟、骨骼。但是在外周血及骨髓中未發現移植的細胞。

南華等[25]將ADSCs標記后，通過尾靜脈移植到創傷鼠體內。結果顯示，實驗組較對照組創口收縮率大，創面完全愈合時間短，新生血管形成、成纖維細胞、腺樣結構更為明顯。多個器官標本行快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察到肺、脾中滯留大量且較強的熒光，肝、心、腎內可見較多細弱熒光，遠隔部位的正常皮膚軟組織僅見少量熒光；創面愈合組織中所見的熒光要多于正常皮膚組織且分布相對有規律。對照組均未見有熒光。他們又將創面局部注射和尾靜脈注射對創面愈合速度及細胞分布情況的影響進行比較。發現當兩種途徑注入等量ADSCs時，局部途徑創面愈合相對較快，但是在愈合時間上與全身途徑比較并無顯著差異。組織學觀察發現局部途徑創面內形成不成熟的腺樣結構相對較多，全身途徑創面內新生血管形成更為明顯[26]。

4 臨床應用

4.1 放射性損傷

Rigotti等[27]對20個接受放射治療后出現副作用（嚴重癥狀或不可逆功能損傷，LENT-SOMA評分3~4級）的患者進行ADSCs治療，將ADSCs通過低侵入性的電腦輔助注射，移植入靶部位。治療后的31個月中，靶部位的超微結構顯示了組織的逐步再生，包括新生血管形成和水化的提高。所有被評估的者都出現了癥狀的緩解。

4.2 復雜性肛瘺

Garcia-Olmo等[28]通過第二階段的多中心隨機對照試驗，探索了ADSCs對復雜性肛瘺治療的有效性和安全性。在ADSCs治療后8周和1年，評估瘺的愈合及生活質量。結果顯示ADSCs可加快肛瘺的愈合，并且提高患者的生活質量分數。

4.3 鼻部區域性壞死

Sung等[29]報道了兩例因鼻部填充劑注射，鼻部出現焦痂及區域性壞死等急性并發癥的患者，予以鼻部清創后在創面皮下和真皮層局部注射ADSCs。注射細胞后未予以其他任何治療，8~10 d后創面完全上皮化，數月后皮膚上只留有一條不明顯的線狀瘢痕，并且沒有瘢痕收縮引起的不對稱或畸形。

綜上所述，脂肪干細胞可以在創面愈合的各個階段發揮作用，但是其體內分化及旁分泌作用機制及效率仍未完全清楚。脂肪干細胞可以通過與基因治療聯合、改進移植方式及改變培養條件等，增強它的分化及分泌功能，局部或全身不同的細胞移植途徑對創面愈合的作用亦有不同。相信在不遠的將來，通過對脂肪干細胞在體內的作用機制、有效性及安全性進行更深入的探索及研究，可以使脂肪干細胞更廣泛地應用于臨床，給創面不愈或難愈的患者提供新的治療手段。

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Research Progress of Adipose-derived Stem Cells on Wound Healing

YU Xiaofan,XIONG Meng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University.Corresponding author:XIONG Meng(E-mail: bearbrave@sina.com).

Adipose-derived stem cells;Wound healing;Clinical application

Q813.1+1

B

1673－0364（2013）02－0109－04

2013年1月17日；

2013年2月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.012

210009江蘇省南京市中大醫院整形外科。

熊猛（E-mial：bearbrave@sina.com）。

【Summary】Would healing is a complicated process,involving multiple cells and various cytokines.Non or poor healing wound still remains to be a big challenge for plastic surgeons.With the deepening of ADSCs researches and clinical applications,ADSCs hold great promise in the wound healing strategies.This review aims to summarize the mechanism of how ADSCs promote would healing,the advanced ADSCs based strategies,the transplantation of the ADSCs and the clinical applications.