草甘膦對青鳉魚卵黃蛋白原的誘導及其潛在分子機理

夏 爽,趙硯彬,楊鳴琦,胡建英*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西 楊凌 712100；2.北京大學城市與環境學院,北京 100871)

有機磷類化合物在農業生產中被逐漸廣泛應用.近年來,隨著一系列低毒有機磷農藥[1-2]、阻燃劑[3]等有機磷化合物的開發和市場化,有機磷類化合物在人類生活以及工農業生產中占的地位越來越重要,其毒性也隨之受到人們的重視.

長久以來,人們對有機磷化合物毒性的關注大多只集中在急性神經毒性上[4],對其內分泌干擾作用如雌激素效應,則研究甚少.體外實驗表明有機磷化合物并不能通過結合雌激素受體而引起雌激素效應.如Chen等[5]通過MCF-7細胞體外增殖實驗和雌激素受體體外結合活性實驗證明,辛硫磷、馬拉硫磷、樂果和久效磷 4種有機磷農藥并不顯示雌激素效應; Kojima等[6]也利用體外雌激素受體結合實驗證明久效磷等有機磷農藥不能引起雌激素效應.近年來也有文獻報道了有機磷類物質對腦垂體促性腺激素具有一定的干擾作用.如 Esmail等[7]將二嗪磷暴露雄性小鼠,導致其血清中促黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)含量升高;Joshi 等[8]將雄性大鼠暴露于乙酰甲胺磷,也同樣觀察到血清中LH、FSH含量的上升,顯示有機磷可影響腦垂體促性腺激素的合成.但是有機磷類物質是否能夠通過對腦垂體促性腺激素的干擾作用產生雌激素效應還沒有相關的報道.

草甘膦,由于高效、低毒、廣譜、內吸傳導非選擇的特點,近年來成為全世界應用最廣的有機磷除草劑[9],具有較高的環境濃度.Sanchís等[10]在西班牙檢測了 140個不同地區地下水樣品中,有 41%檢出了草甘膦,平均濃度為 200ng/L,最高濃 度 為 2.5μg/L;Popp 等[11]調 查 了 奧 地 利Vorarlberg地區最主要的河流,草甘膦濃度大約為0.67μg/L;Peruzzo等[12]對阿根廷布宜諾斯艾利斯省某主要農產區河流調查顯示,草甘膦甚至達到 0.70mg/L.但是目前對草甘膦毒性的研究集中于急性毒性上,沒有關于草甘膦內分泌干擾作用方面的研究.

本研究以青鳉魚為實驗動物,通過定量 PCR評估了草甘膦對肝臟VTG的潛在誘導作用,并通過分析調控雌激素合成的一系列腦垂體性腺軸關鍵基因和肝臟雌激素代謝酶基因的表達變化對其誘導機理進行了深入的解析.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40wt.%草甘膦異丙胺鹽水溶液,購自 sigma;trizol,購自invirogen;M-MMLV反轉錄套裝,購自康維世紀;SYB ?Green PCR Master mix,購自invirogen.

1.2 實驗用魚飼養

青鳉魚(Orange-Red strain)由本實驗室繁殖并飼養,養殖用水為經活性碳過濾并曝氣的自來水.水溫控制在(25±1)℃,水硬度(以 CaCO3計)為(81.1±1.2)mg/L, pH 值為 7.9±0.1,溶解氧為(7.8±0.3)mg/L.光周期為 16h： 8h(晝：夜),以豐年蟲(Artemia nauplii)剛孵化出的幼蟲為餌料,每天上午下午各喂食一次,并及時清除多余餌料和排泄物.

1.3 暴露實驗

采用剛孵化出 1～3d(1～3dph)的魚苗,進行暴露實驗.共設置5個濃度梯度,每個梯度的草甘膦異丙胺鹽濃度分別為 0.2,2,20,200,2000μg/L.以經活性碳過濾并曝氣的自來水做空白對照.每日全量換水.用超純水稀釋40wt.%草甘膦異丙胺鹽水溶液配制一系列濃度為 0.004,0.04,0.4,4,40μg/μL 的標樣,取 200μL 的上述標樣到對應的4L暴露池中,使暴露池終濃度分別為 0.2,2,20,200,2000μg/L.

暴露持續5周,在最后1d,每組隨機取雌雄魚各6條,用冰塊麻醉,然后每條魚分別取肝臟、性腺和腦,做好標記,放入液氮中,用來提取總RNA.

1.4 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

采用Trizol試劑分別提取肝臟、腦、性腺組織總RNA,然后對提取的總RNA進行DNase I處理和純化.所得總RNA紫外光吸收A260/280大于1.8.采用HiFi-MMLV逆轉錄酶和OligodT15引物合成cDNA第一條鏈.

1.5 熒光定量PCR檢測

根據本實驗室已建立的方法,用ABI7500型熒光定量 PCR儀進行熒光定量 PCR檢測,RPL-7用作內參基因校正實驗誤差[13].Primer Premier 5.0(Premier Biosoft)設計所測基因的引物序列,設計時盡可能的跨越內含子,以降低DNA污染.引物具體序列見表1,由北京三博遠志生物技術公司合成.

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primer pairs of SYBR? Green real-time PCR

1.6 數據處理

定量 PCR數據以 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量.采用SPSS軟件(Ver 11.5; Chicago, IL,美國)的獨立樣品t檢驗,來檢驗不同暴露組和對照組的基因表達差異的顯著性,P＜0.05為差異顯著.每個基因的不同濃度暴露組的基因表達量用對照組基因表達量的倍數表示.

2 結果

2.1 肝臟卵黃蛋白原基因表達變化

圖1 草甘膦暴露對青鳉魚肝臟中卵黃蛋白原(VTG I)表達量的影響Fig.1 Vitellogenin gene expression in liver of medaka exposed to glyphosate

在雌性幼魚中,草甘膦在低濃度下(0.2μg/L)即可顯著誘導雌魚卵黃蛋白原基因表達 (P＜0.05),但是隨著暴露濃度的增加,VTG I的表達量逐漸降低,呈現明顯的劑量效應關系.隨著暴露濃度的升高,VTG各濃度組基因表達量分別為對照組的101.36、41.76、11.92、5.26、5.34倍(圖1a).在高濃度組(200,2000μg/L),和對照比VTG I基因表達雖仍有所增加,但并不顯著.在雄魚中,草甘膦對VTG I基因表達誘導呈現先升后降的趨勢：濃度為0.2、2、20μg/L時,VTG I基因表達量分別為對照組的1.64、2.87、41.35倍,濃度增加到200, 2000μg/L時,VTG I的表達量分別是對照組的13.92和1.31倍(圖1b).除最低暴露組(0.2μg/L)和最高暴露組(2000μg/L),其余各組 VTG I均被顯著誘導.

2.2 雌激素合成和代謝酶基因表達變化

2.2.1 腦垂體性腺軸基因表達變化 對垂體性腺軸中的15個基因進行了檢測.其中3個下丘腦促性腺激素釋放激素(cGnRH、mdGnRH、sGnRH)基因[14]和 3個垂體促性腺激素亞基(GtHα、FSHβ、LHβ)基因[15-16],分別調控垂體促性腺激素和性腺中性激素的合成分泌.另外,還涉及9個激素合成相關基因(StaR、HMGR、CYP11A、CYP11B、CYP17、CYP19A、3β-HSD、17β-HSD I、17β-HSDⅢ).在類固醇激素合成的早期步驟,膽固醇的合成主要由羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶(HMGR)這一酶調控[17].類固醇急性調節蛋白(StAR)負責將膽固醇轉運至線粒體內,啟動類固醇激素的合成[18].CYP11A催化膽固醇生成孕烯醇酮,這是類固醇激素生物合成的起點,后經3β-HSD酶催化合成孕酮.CYP17酶具有17α-羥化酶和 17,20-裂解酶兩種活性,可分別催化生成17α-羥基孕酮和雄烯二酮,兩個合成下游雌雄激素的前體物.CYP19A和CYP11B分別調控雌激素雌二醇(E2)和雄激素 11-酮基睪酮(11-KT)的合成[19-20].17β-HSD I可使雌酮轉化為生物活性更高的雌二醇.17β-HSDⅢ為雄激素的代謝酶,使雄烯二酮還原為睪酮[21].該 15個基因基本涵蓋了整個垂體性腺軸調控性激素合成過程[22].本研究通過定量PCR檢測,篩選出顯著受到草甘膦影響的基因,以進一步解釋草甘膦雌激素效應的分子機理.

圖2 草甘膦暴露對青鳉魚垂體性腺軸關鍵基因表達量的影響Fig.2 Hypophysial-gonadal axis key genes expression of medaka exposed to glyphosate

結果顯示,在雌魚中,從低濃度組到高濃度組,腦部 FSHβ mRNA相對表達量分別為對照組的3.71、1.19、0.87、0.72、0.90 倍.如圖 2a,在 0.2μg/L草甘膦暴露下,雌魚的 FSHβ 表達顯著上調(P＜0.05),其他各濃度組變化不顯著;性腺CYP19A和17β-HSD I基因相對表達量分別為對照組的2.16、1.33、1.18、1.42、0.77 倍(圖 2c)和 1.49、1.95、1.19、1.25、0.87倍(圖 2e).CYP19A 基因在 0.2μg/L 草甘膦濃度下,被顯著誘導(P＜0.05),而其他濃度組表達量相對對照組沒有明顯變化,但隨濃度升高而逐漸下降.17β-HSDI基因在2μg/L草甘膦濃度下被顯著誘導(P＜0.05),在其余各濃度組該基因表達并沒有顯著變化.

從低濃度組到高濃度組,雄魚腦部 FSHβ mRNA相對表達量分別為對照組的0.91、1.19、1.85、1.12、1.23倍(圖 2b),但是只有在 20μg/L時,才被顯著誘導(P＜0.05);雄魚 17β-HSDI 基因相對表達量分別為對照組的2.31、2.90、4.33、7.98、3.08 倍(圖 2f).在 0.2μg/L和 2000μg/L 濃度時,17β-HSD I 表達量顯著上升(P＜0.05),其余各組中17β-HSD I基因表達量呈現上升趨勢,相對對照組均有2倍以上差異,但并不顯著.

圖3 草甘膦暴露對青鳉魚肝臟中主要雌激素代謝酶CYP1A、CYP1B和CYP3A表達量的影響Fig.3 Expression of estrogen-related metabolic genes in liver of medaka exposed to glyphosate

2.2.2 雌激素代謝酶基因表達變化 各濃度組草甘膦暴露均能顯著抑制雌魚體內雌激素代謝酶基因的表達(P＜0.05).CYP1A、CYP1B 和 CYP3A mRNA表達量,按濃度遞增的順序,分別為對照組的 0.42、0.19、0.27、0.26、0.66 (CYP1A)倍;0.06、0.35、0.15、0.26、0.11(CYP1B)倍和 0.31、0.20、0.23、0.18、0.21(CYP3A)倍(圖 3a、3c 和3e).CYP1A的表達量,隨著暴露濃度的升高,呈現先降后升的U型變化趨勢,而CYP1B和CYP3A各濃度組的表達量則相對穩定.

如圖3b、3d和3f,從低濃度到高濃度的各暴露組中,雄魚 CYP1A mRNA表達量分別為對照組的0.38、0.12、0.27、0.17、1.16倍;CYP1B表達量分別為0.44、0.15、0.36、0.42、2.94倍;CYP3A表達量分別為0.55、0.32、0.38、0.45、0.70倍.除了CYP1A和CYP1B在最高濃度組表達量和對照組無顯著差異,雄魚肝臟雌激素代謝酶的表達在其他濃度組均被顯著抑制(P＜0.05),并且隨著暴露濃度的升高,均呈現出先降后升的U型表達模式.

3 討論

本研究中,草甘膦暴露能夠顯著誘導雌雄青鳉魚中 VTGI基因的表達,并呈現一定的劑量效應關系(圖1),表明草甘膦具有一定的雌激素效應.并且雄魚 VTGI基因誘導能力明顯小于雌魚,這與 Bickley等[23]的研究結果一致,即雌魚對雌激素物質較雄魚更加敏感.

Petit等[24]通過酵母雙雜交篩選實驗,證明草甘膦本身并不具有雌激素受體結合活性,Hiroyuki Kojima等[6]利用轉染人雌激素受體和雌激素反應元件重組質粒的中國倉鼠肝細胞進行草甘膦雌激素受體結合活性實驗,也得到相似的結果.這些實驗結果說明草甘膦并不能直接介導雌激素受體而誘導肝臟 VTG表達.大量文獻[25-27]已經證明,魚體內 VTG 合成主要依賴于血液中雌二醇(17β-E2)濃度水平,并受到 17β-E2的直接調控,因此為了進一步分析草甘膦誘導VTGI表達的潛在機理,本研究測定了雌激素合成和代謝相關基因的表達變化.

芳香化酶(CYP19)和 17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSDI)是促進性腺雌激素合成的兩個重要酶,能夠將睪酮(Testosterone,T)轉化 17β-E2、雌酮(Estrone,E1)轉化 17β-E2[28].在草甘膦雌魚2μg/L 暴露組,性腺17β-HSDI顯著表達(P＜0.05),可能對VTG的上升具有一定貢獻.而在脊椎動物中,肝臟細胞色素450酶(CYP450s)中的CYP1A、CYP1B和CYP3A是將17β-E2代謝為2-羥雌二醇(2-OHE2)的主要酶[29],研究表明,在魚類中,CYP1A在17β-E2代謝中起到的作用更大[30].

結果顯示,雌魚腦部FSHβ和性腺CYP19A在最低濃度下即被顯著表達(P＜0.05),而后隨暴露濃度的升高,表達量呈現降低的趨勢,顯示出與雌魚 VTG相似的表達模式.這可能是由于腦部 FSH可以提高性腺芳香化酶(CYP19A)的表達量和活性[31-32],從而增加了性腺雌激素合成,最終導致 VTG合成量升高.另一方面雌魚肝臟雌激素代謝酶,在各暴露濃度組均被顯著抑制(P＜0.05),這種抑制作用與毒死蜱抑制 CYP1A表達的報道類似[33-34].

同雌魚相似,雄魚肝臟雌激素代謝酶表達也被顯著抑制.另外,在 E2代謝過程中起到作用更大的CYP1A,呈現U型的表達模式,和雄魚VTG基因表達的倒 U型的劑量效應關系一致.據Anderson等[35]以虹鱒魚肝細胞進行的體外實驗顯示,CYP1A表達同VTG的合成具有負相關性.因此,草甘膦抑制雄魚體內雌激素代謝而誘導肝臟VTG基因表達.除了代謝因素,雄魚腦部FSHβ雖然具有和 VTG相同的表達模式,但性腺CYP19A基因在各濃度組均未有顯著變化.雄魚17β-HSDI在最低和最高兩個濃度組,均有顯著表達(P＜0.05),但是這兩組的VTG表達量并沒有顯著變化,而在 VTG表達量顯著上升的實驗組,雄魚 17β-HSDI均有兩倍以上的升高,不過由于組內差異較大,并沒有顯著性.說明雄魚17β-HSDI在 VTG上升過程中可能并不起關鍵作用.

4 結語

一定濃度范圍內草甘膦可以誘導青鳉魚VTG 表達,顯示雌激素效應.并且其雌激素效應的誘導機理在雌雄魚中存在一定的差異.在雌魚體內草甘膦通過上調腦部 FSH表達,誘導CYP19A表達,從而加強了雌激素合成能力.而在雄魚中,則主要通過抑制肝臟雌激素代謝酶(CYP1A 和CYP3A),使體內17β-E2濃度升高從而誘導VTG表達變化.

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