亞硝態氮脅迫對日本蟳消化酶活力及同工酶表達的影響

許星鴻,張雁秋,閻斌倫,劉艷晴,陳 松,黃福林,唐 瑤 (1.中國礦業大學環境與測繪學院,江蘇 徐州 1008；.淮海工學院海洋學院,江蘇 連云港 005)

亞硝態氮是氨氧化成硝態氮的中間產物,是反映水質狀況的重要指標之一[1].在集約化養殖系統中,由于養殖密度和投餌量的加大,積累的殘餌,代謝廢物等有機物往往造成養殖水體中亞硝態氮濃度的升高,嚴重影響養殖對象的生理代謝功能[2-3].日本蟳(Charybdis japonica)廣泛分布于我國各海區,為經濟價值較高的海產蟹類[4].許星鴻等[5]就亞硝態氮脅迫對日本蟳免疫相關指標的影響進行了研究,但迄今尚未見有關亞硝態氮脅迫對日本蟳消化酶和同工酶影響的報道.消化酶活力的高低直接反映了機體對營養物質消化吸收的能力,進而影響到機體的存活與生長,而同工酶是生物體代謝的調節者,可以呈現機體代謝的一些變化.本文研究了亞硝態氮脅迫下,日本蟳肝胰腺消化酶活力的變化規律以及對同工酶表達的影響,旨在探討亞硝態氮對日本蟳的毒性作用,為人工養殖的水質調控及相關毒理學研究提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料

日本蟳于2011年11月購自連云港市贛榆縣海濱,采用生態閉路循環養殖系統暫養 7d,鹽度25,pH8.0,水溫 15℃,自然光照,連續充氣,一日投喂2次鮮活貝類.選擇附肢完整,活力強且大小相近者用于實驗.甲長為(5.85±0.51)cm,甲寬為(7.69±0.62)cm,體質量為(94.22±22.37)g.

1.2 實驗梯度設置

亞硝態氮源為亞硝酸鈉,為國產分析純.根據預實驗所得亞硝酸鈉對日本蟳的半致死濃度(96h-LC50為75.34mg/L)以及養殖水體通常的亞硝態氮污染濃度[3],亞硝酸鈉濃度設 7組:對照組(0mg/L),0.15,0.3,2,5,10,20mg/L,每組設 3 個平行,每個平行隨機取22只蟹,飼養7d.水溫,投餌,充氣等養殖條件與暫養時相同.每日定時換水2次,并維持各組亞硝酸鈉質量濃度.于實驗0,0.5,1,3, 5,7d,每個平行隨機取 3只蟹,置冰盤內解剖,取出肝胰腺,保存于-80℃待測消化酶活力.于實驗第7d,分別取對照組和高濃度(20mg/L)組的鰓,肌肉,肝胰腺,胃,心臟,卵巢,精巢等組織,-80℃保存備用于同工酶實驗.

1.3 樣品制備

取上述樣品,以1:5(W/V)加入0.1mol/L預冷磷酸鹽緩沖液(pH7.0),冰浴研磨勻漿 5min,取部分肝胰腺勻漿液直接用于測定脂肪酶活力,其余勻漿液用高速冷凍離心機(0～1℃)以 10000r/min的轉速離心 30min,取上清液用于其他消化酶或同工酶檢測.

1.4 檢測方法

蛋白酶活力測定采用福林－酚法[6],淀粉酶和纖維素酶活力測定分別采用淀粉－碘顯色法和 3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法[7],脂肪酶活力測定采用 NaOH滴定法[8].樣品蛋白含量采用南京建成生化試劑盒測定.

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行同工酶檢測,濃縮膠濃度為 4%,分離膠濃度為 10%,樣品在濃縮膠中時的電壓為 80V,進入分離膠后電壓調整為 120V,4℃下電泳.同工酶顯色方法參照毛盛賢[9]的方法.

1.5 數據分析

酶活力數據以“平均數±標準差”表示,采用SPSS16.0軟件進行統計分析,進行單因子方差分析(One-Way ANOVA),LSD(Least Significant Difference)多重比較和Duncan檢驗.顯著水平設為0.05.顯色固定后的凝膠用美國伯樂ChemDoc XRS型凝膠成像系統進行拍照,本文所有電泳圖譜上方為陰極,下方為陽極,各酶譜的酶帶根據其相對遷移率Rf由大到小編號,即自陽極方向的酶帶開始依次編號為1,2,3…….

2 結果

2.1 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺消化酶活力的影響

2.1.1 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影響 由表 1可見,亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影響基本表現為“先誘導后抑制”.在處理0.5d時,除20mg/L組外,其他實驗組酸性蛋白酶活力均受到不同程度的誘導,以5mg/L組誘導程度最為顯著.隨著脅迫時間的延長,0.15和0.3mg/L兩組酸性蛋白酶活力于第5d升至最高,2mg/L組酸性蛋白酶活力最大值出現于第3d,而脅迫濃度5mg/L及以上的處理組酸性蛋白酶活力均在脅迫第1d升至最高,隨后出現下降.至處理 7d時,高濃度(10,20mg/L)處理組酸性蛋白酶活力顯著低于對照組(P＜0.05).

觀察特定時間的效應-劑量關系,可發現處理0.5d時,脅迫濃度5mg/L以下的處理組酸性蛋白酶活力與劑量濃度之間存在正相關關系(r=0.913, P＜0.05).處理7d時,脅迫濃度2mg/L及以上的處理組酸性蛋白酶活力與劑量濃度之間則呈現負相關關系(r=-0.972,P＜0.05).

表1 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力(U/mg蛋白)的影響Table 1 Effect of nitrite stress on acid protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.2 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺堿性蛋白酶活力的影響 從表 2可看出,在亞硝態氮脅迫下,堿性蛋白酶活力在不同的劑量濃度下表現出不同的變化規律:在5mg/L及以下的處理組,堿性蛋白酶活力表現為“先誘導后抑制”,誘導程度以0.3mg/L組最為顯著;10mg/L組堿性蛋白酶活力表現為“先抑制后誘導再抑制”;而 20mg/L組堿性蛋白酶活力在處理 0.5d時,受抑制程度較大,雖然在處理1d時有小幅回升,但隨后呈持續下降趨勢.至處理7d時,脅迫濃度5mg/L及以上的處理組堿性蛋白酶活力低于對照組(P＜0.05).

觀察某一時間的效應-劑量關系,0.3mg/L及以上的實驗組在處理第5d和第7d時,堿性蛋白酶活力與劑量濃度間均呈顯著負相關關系(P＜0.01).

表2 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺堿性蛋白酶活力(U/mg 蛋白)的影響Table 2 Effect of nitrite stress on alkali protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.3 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺脂肪酶活力的影響 由表3可知,在亞硝態氮脅迫下,各實驗組脂肪酶活力均呈現“先誘導后抑制”的變化規律,誘導程度以10mg/L組最大,在0.5d時,其脂肪酶活力升高至對照組的1.4倍.5mg/L及以下的實驗組脂肪酶活力于脅迫 1d時升至最大,而10,20mg/L兩組最高值出現于處理 0.5d,隨后呈下降趨勢.至處理7d時,2mg/L及以下的實驗組脂肪酶活力高于對照組,而 10,20mg/L兩組脂肪酶活力顯著低于對照組(P＜0.05).

在亞硝態氮脅迫對脂肪酶的效應與劑量關系方面,濃度10mg/L以下的短期脅迫(0.5d和1d)下,脂肪酶活力與劑量濃度間呈正相關關系,相關系數分別為:r=0.946(P＜0.01)和 r=0.831(P＜0.05).而脅迫濃度2mg/L及以上的實驗組在處理第5d和第7d時,堿性蛋白酶活力與劑量濃度間均呈顯著負相關關系,相關系數分別為:r=-0.957(P＜ 0.05)和r=-0.993(P＜0.01).

表3 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺脂肪酶活力(×10-3U/mg蛋白)的影響Table 3 Effect of nitrite stress on lipase activity of hepatopancreas(×10-3U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.1.4 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響基本上表現為抑制(表4).2mg/L及以上的實驗組淀粉酶活力持續下降,于處理5d后趨于平穩,顯著低于對照組(P＜0.05).

在實驗期間,淀粉酶活力與劑量濃度間均呈顯著負相關關系(P＜0.01).

2.2 亞硝態氮脅迫對日本蟳同工酶的影響

表4 亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響(U/mg 蛋白)Table 4 Effect of nitrite stress on amylase activity of hepatopancreas(U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.2.1 亞硝態氮脅迫對日本蟳 α-淀粉酶 α-AMY同工酶的影響 如圖 1所示,在對照組中,α-AMY 同工酶在鰓中顯示出 3條酶帶:α-AMY-1,α-AMY-2 和 α-AMY-3;在肝胰腺中顯示出2條酶帶:α-AMY-1和α-AMY-2;而在肌肉,卵和胃中僅表達出α-AMY-1活性.3條酶帶活性強弱依次為:α-AMY-1＞α-AMY-2＞α-AMY-3,α-AMY-1在不同組織中的表達活性依次為:肝胰腺＞胃＞肌肉＞卵＞鰓.在亞硝態氮脅迫下,各處理組 α-AMY活性均有所下降,其中鰓處理組僅表達1條酶帶α-AMY-1,肝胰腺處理組酶帶數量未減少,但活性減弱.

2.2.2 亞硝態氮脅迫對日本蟳乳酸脫氫酶LDH同工酶的影響 LDH同工酶在日本蟳肌肉,卵子,精子和心臟中均表達出1條酶帶(圖2),酶帶活性強弱依次為:肌肉＞精子＞心臟＞卵.在亞硝態氮脅迫下,各處理組 LDH 表達均有所減弱,以卵處理組LDH活性最低.

2.2.3 亞硝態氮脅迫對日本蟳蘋果酸脫氫酶MDH同工酶的影響 由圖3可見,MDH同工酶共表達出7條酶帶,其中MDH-1,MDH-4和MDH-7在肌肉,卵,精子,鰓和心臟中均有表達,而 MDH-2,MDH-3,MDH-5和MDH-6的表達表現出明顯的組織特異性:MDH-2在鰓中不表達;在卵和精子中表達MDH-3,但未表達 MDH-5;MDH-6僅在鰓中有微弱表達.在亞硝態氮脅迫下,肌肉處理組 MDH-1活性有所下降,MDH-5和MDH-7兩條酶帶消失,但新增兩條酶帶:MDH-2和MDH-4,且活性較強;鰓處理組MDH-1活性比對照組略強;其他各處理組MDH同工酶均出現活性下降甚至酶帶消失現象.

圖1 亞硝態氮脅迫對日本蟳淀粉酶α-AMY同工酶的影響Fig.1 Effect of nitrite stress onα-amylase isozymes of Charybdis japonica

圖2 亞硝態氮脅迫對日本蟳乳酸脫氫酶LDH同工酶的影響Fig.2 Effect of nitrite stress on lactate dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

圖3 亞硝態氮脅迫對日本蟳蘋果酸脫氫酶MDH同工酶的影響Fig. 3 Effect of nitrite stress on malic dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

2.2.4 亞硝態氮脅迫對日本蟳過氧化物酶POD同工酶的影響 從圖4可看出,對照組POD同工酶的表達表現出明顯的組織特異性:肌肉和鰓均表達 POD-4和 POD-6;肝胰腺表達 POD-5和POD-6;心臟表達 4條酶帶:POD-2,POD-3,POD-4和POD-6;除POD-4以外的5種POD同工酶在卵中均有表達.在本實驗高濃度(20mg/L)亞硝態氮脅迫 7d后,除肝胰腺處理組的 POD-6有微弱表達外,其他各處理組均未檢測到POD同工酶活性.

圖4 亞硝態氮脅迫對日本蟳過氧化物酶POD同工酶的影響Fig.4 Effect of nitrite stress on peroxidase isozymes of Charybdis japonica

3 討論

3.1 環境脅迫對甲殼動物消化酶活力的影響

甲殼動物消化酶活力是反映其消化生理機能的重要指標,環境因素能通過改變消化酶活力而影響到機體的生長甚至生存.王維娜等[10]報道水體中適量的金屬離子可激活日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)消化道中胃蛋白酶和類胰蛋白酶的活性,高濃度時則有抑制作用.徐武杰等[11]研究表明三疣梭子蟹(Portunus trituverculatus)在氨氮(1,5,20mg/L)脅迫下消化酶活力呈現明顯的峰值變化,至24h和48h時趨于穩定,肝胰腺胃蛋白酶和脂肪酶活力與氨氮脅迫濃度呈正相關,而淀粉酶活力與劑量濃度呈明顯負相關.Antoine等[12]研究發現歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)在濃度為 0.53～16.11mg/L的氨氮慢性脅迫下飼料轉化率隨著氨氮濃度升高而升高.本實驗中,較低濃度(≤10mg/L)的亞硝態氮脅迫對日本蟳肝胰腺消化酶活力產生一定的誘導效應,而高濃度(20mg/L)的亞硝態氮脅迫對堿性蛋白酶和淀粉酶活力表現出明顯的抑制效應,與上述環境脅迫對甲殼動物消化酶活力的影響規律相近.

研究表明環境脅迫會導致甲殼動物產生應激反應,生理代謝發生較大的變化,如耗氧量增大,能量需求增加以及免疫相關酶活力升高等[13-14].Stebbing[15]把這種在毒物作用下生物酶出現的增益現象稱為“毒物興奮效應”.一定濃度亞硝態氮脅迫下,日本蟳消化酶活力的升高可提高機體對餌料的消化能力,利于補償因應激反應所增加的能量消耗.但是當亞硝態氮超過一定的閾值或者長期處于脅迫條件下,日本蟳的溶菌酶等免疫酶活力會出現顯著下降[16].在本實驗中處理 7d時,脅迫濃度2mg/L及以上的實驗組各消化酶活力與劑量濃度間均呈明顯負相關,表明亞硝態氮的過度脅迫會顯著影響到機體的消化功能.

3.2 環境脅迫對甲殼動物同工酶表達的影響

同工酶是廣泛存在于生物體同一種屬或同一生物不同組織器官,由不同基因位點或等位基因編碼的多肽鏈的單體,純聚體或雜聚體,能催化相同化學反應,但其理化或生物性質不同的酶,可作為基因表達的分析工具[9].本實驗中日本蟳不同組織的α-AMY,LDH,MDH和POD等4種同工酶的表達均表現出明顯的組織特異性,與宋微微等[17]的研究結果相一致,其中關于日本蟳POD同工酶的表達分析屬首次報道.

王蘭等[18-19]報道高濃度的鎘脅迫對河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)POD同工酶以及中華絨螯蟹(Eriocheir siensises)酯酶EST同工酶均表現出明顯的抑制作用.俞亞東等[20]研究發現高濃度的銅和鋅都會導致羅氏沼蝦鰓中超氧化物歧化酶 SOD條帶變窄,顏色變淡.本實驗中,高濃度亞硝態氮的脅迫對日本蟳的α-AMY,LDH, MDH和POD等同工酶表達均表現出一定的抑制作用.LDH與運動供能相關,MDH是三羧酸循環中催化蘋果酸和草酰乙酸相互轉變的酶,其含量能影響糖的有氧氧化反應的進行及ATP的合成[17].而POD是抗氧化功能酶,能催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應,可與SOD協同作用清除生物體在逆境脅迫下產生的大量自由基[21].α-AMY,LDH,MDH和 POD等同工酶的活性降低表明機體的消化,能量代謝及抗氧化功能等均受到影響.高濃度亞硝態氮脅迫下,日本蟳肌肉中新增兩條活性較強的酶帶(MDH-2和MDH-4)可能與機體處于逆境中能量消耗大,代謝負荷加重有關.關于較低程度的環境脅迫對日本蟳同工酶表達的影響尚需進一步研究.

國家漁業水質標準中未對亞硝態氮濃度有明確要求,但一些地方標準提出了水質中亞硝態氮的上限濃度,如舟山市海洋與漁業局水質標準中規定亞硝酸鈉濃度≤0.3mg/L,而崇明農業網推薦養殖水體亞硝酸鹽濃度以≤0.15mg/L為宜.本研究表明,日本蟳在 0.15,0.3mg/L的亞硝態氮脅迫 7d后,消化酶活力基本上無顯著變化,表明低濃度的亞硝態氮脅迫對日本蟳消化功能未造成明顯影響.濃度在2mg/L及以上的亞硝態氮脅迫導致日本蟳消化酶的活力顯著降低,20mg/L的高濃度亞硝態氮脅迫可造成日本蟳同工酶表達的活性減弱,表明亞硝態氮的過度脅迫會顯著影響機體的消化,能量代謝及免疫等功能,可能會導致疾病暴發,這在養殖生產中值得注意.

4 結語

日本蟳消化酶活力可被低濃度(0.15,0.3mg/L)的亞硝態氮脅迫所誘導,且在處理7d時,仍保持在較高的水平;較高濃度(2,5,10mg/L)亞硝態氮的短期脅迫(0.5～1d)會誘導酸性蛋白酶,堿性蛋白酶和脂肪酶活力的迅速升高后又快速下降;而高濃度(20mg/L)的亞硝態氮脅迫顯著抑制日本蟳消化酶活力和同工酶表達.

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