含熒光素酶四膜蟲B2086-LUC全細胞生物傳感器的構建及其對重金屬離子的響應

張鵬幸,許 靜,盧劍功,王 偉

(山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原030006)

環境中的重金屬污染不能被微生物有效降解,并會通過食物鏈的生物積累作用富集.幾乎所有的重金屬都能對生物體產生毒害作用[1-2].對重金屬的有效監測是對環境保護和人類健康安全保障的重要手段.理化監測方法在環境監測中起到重要的作用,但是這些方法不能區別重金屬在生物系統中的有效作用部位和有效評價環境中重金屬的生物利用度及遺傳毒性.生物測試和生物傳感器克服和補充理化監測的不足,已發展為評估重金屬污染的有效工具.生物監測既可評價污染物的遺傳毒性,也可針對金屬離子的有效作用部位進行檢測.通過觀察斑馬魚胚胎發育,評價了納米碳化鎢和1,2,4-三氯苯的水生態毒理效應[3-4].全細胞生物傳感器(Whole Cell Biosensor,WCB)可以特異性的對金屬離子的刺激產生應激,并將信號放大,反應靈敏,監測快速,已發展為一種重要的生物監測手段[5].

纖毛類原生動物是單細胞真核生物,沒有細胞壁,對環境污染具有很高的敏感性,具有對環境污染更快的響應機制[6].纖毛類原生動物用于環境污染檢測的方式有2種類型：“turn off”和“turn on”[7].在“turn off”試驗中,基于生長速率、發光度、細胞群落的色度等的降低,對細胞活性抑制水平進行檢測.嗜熱四膜蟲突變體生產過剩的黑色素前體成功檢測霉菌毒素[8].在“turn on”試驗中,一個可定量的分子報告元件與一個特定的基因啟動子連接,當受到環境污染物刺激后,細胞能夠做出快速響應[8-10].金屬硫蛋白基因啟動子能夠對多種重金屬做出快速、靈敏的應激反應.在嗜熱四膜蟲中,MTT1和MTT3基因的啟動子對鎘離子的響應敏感,MTT2和MTT4基因的啟動子對銅離子的響應敏感,而MTT5基因的啟動子對汞離子的響應敏感[11],所以它們能夠用于構建不同類型的WCB.熒光素酶因其容易被檢測而廣泛的用作報告系統[5].

本研究為了獲得可以快速檢測重金屬的WCB,以嗜熱四膜蟲為材料,構建了一種含有螢火蟲熒光素酶基因的重組四膜蟲WCB,并檢測了該細胞株對重金屬鎘、汞、銅和鋅的響應.

1 材料和方法

1.1 細胞株和質粒

嗜熱四膜蟲(T.thermophila)B2086細胞株(美國康奈爾大學Peter J.Bruns博士惠贈);質粒pBX(羅徹斯特大學Martin A.Gorovsky教授惠贈),含有HA標簽、MTT1啟動子、微管蛋白終止子及巴龍霉素抗性基因neo2;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α為本實驗室自行保存,pEASY-T1 Vector購于全式金公司;質粒pGL3-control購自Promega公司.

1.2 試劑和儀器

DNA回收試劑盒(BioFlux公司);質粒抽提試劑盒(BioOMEGA公司);TaqDNA聚合酶和核酸分子量標準(北京TIANGEN公司);PCR引物合成和DNA序列測定由TAKARA公司完成;蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂(上海Sangon公司);氨芐青霉素(華美生物工程公司);螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒E1500(Promega公司);SPP培養基所用示蛋白胨、葡糖糖、酵母提取物、乙二胺四乙酸鈉鹽(Oxoid公司);青霉素、鏈霉素、兩性霉素(華北制藥公司).anti-HA抗體(Cali-Bio公司);HRP標記二抗(Zymed Lab公司);SuperSignal顯色液(Pierce公司);GJ-100高壓氣體基因槍(寧波新芝生物科技公司);GloMaxTM 20/20熒光檢測儀(Promega公司).

1.3 方法

分別對pEASY-T1-LUC和載體pBX進行BamH I酶切和AscI雙酶切,回收酶切產物中的目的片段LUC和目的載體,按比例混合后用T4 DNA連接酶16℃過夜連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5а感受態細胞,在含氨芐霉素的LB固體培養基37℃過夜培養,挑取單菌落在LB液體培養基中培養,提取質粒BamH I和XhoI酶切鑒定.

1.3.2 嗜熱四膜蟲的培養及饑餓 嗜熱四膜蟲B2086培養在50mL SPP培養液中,生長條件為30℃,180r/min振蕩培養;當四膜蟲生長至對數生長期(2.0×105～5.0×105個/mL)時,10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)洗滌1次,并于50mL 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)中饑餓 18～24h.

1.3.3 四膜蟲B2086-LUC的構建及鑒定 構建好的中間載體pBX-LUC用XhoⅠ酶切線性化,并用乙醇純化濃縮后,包裹在金顆粒上,通過GJ-1000基因槍轉入饑餓18～24h的嗜熱四膜蟲B2086中[12-13],4h后加入巴龍霉素(終濃度為100μg/mL)和 CdCl2(終濃度為 0.5μg/mL),分裝到96孔板中,30℃恒溫培養3d后,逐步增加巴龍霉素濃度,LUC基因重組入MTT1位點并逐步取代MTT1基因(圖1).

圖1 載體pBX-LUC與四膜蟲大核基因組同源重組示意Fig.1 Schematic diagram of recombination between plasmid pBX-LUC and Tetrahymena macronulear genome

提取嗜熱四膜蟲基因組,設計引物MTT1F：5′GCTACGTGATTCACGATTTATGCAATG 3′,MTT1R：5′CGAAACTGATTTTATGCAATTAT GAATTAC 3′,PCR擴增鑒定基因的重組效果.

1.3.4 HA-LUC蛋白的免疫印跡法分析 PCR鑒定LUC正確重組的四膜蟲細胞在含0,0.1μg/mL鎘的 SPP培養基中培養至濃度為(2～3)×105個/mL.收集樣品 2×104個細胞并加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液(5%β-巰基乙醇,50%甘油,10%SDS和250mmol/L Tris-HCl,pH6.8)后金屬浴 95℃加熱 5min.將樣品在 10%SDSPAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,1：500稀釋的anti-HA抗體4℃孵育過夜,1：500稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育1h.經SuperSignal化學發光底物顯色液顯色3min后檢測.

1.3.5 四膜蟲B2086-LUC對不同重金屬的響應 野生型四膜蟲和B2086-LUC培養在50 mL SPP培養液中,生長條件為30℃,180r/min振蕩培養.當四膜蟲生長至對數生長期(2.0×105～5.0×105個/mL)時饑餓在 10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分裝5mL/管,分別用終濃度為0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5μg/mL 的 CdCl2;0,0.000 5,0.001,0.01,0.05,0.1,0.2μg/mL 的 HgSO4;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的CuCl2;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的ZnSO4誘導3h.取樣后血球計數板記數3次取平均值;每組樣品分別取2×105個細胞于滅菌后的1.5mL EP管中,平行對照3組;8000r/min離心5min后,棄盡上清,加入200μL裂解液,重懸混勻;取100μL樣品于新的EP管中,同時加入100μL螢火蟲熒光素酶底物,熒光檢測儀檢測并記錄熒光值,受試樣品3次計數取平均值,計算樣品組與對照組熒光值的倍數關系,并繪制熒光值變化倍數-受試樣品濃度關系.

2 結果

2.1重組質粒pBX-LUC的鑒定

以克隆載體pGL3-control為模板,擴增螢火蟲熒光素酶基因LUC,瓊脂糖凝膠電泳檢驗,PCR產物大小與預期相符(圖2A).將PCR產物連接到載體pBX上,重組質粒pBX-LUC經BamH I和XhoI雙酶切后,得到大小分別為7kb的載體片段和2.2kb的含有目的基因LUC的片段(圖2B),重組質粒pBX-LUC的LUC測序結果與已報道的LUC基因序列進行比對,確證本研究克隆的LUC基因序列正確,表明重組質粒pBX-LUC構建成功.

圖2pBX-LUC載體的鑒定Fig.2 Identification of plasmid pBX-LUC

2.2 四膜蟲B2086-LUC的鑒定

酶切、濃縮的pBX-LUC轉化四膜蟲B2086細胞,經同源重組,LUC序列替代大核基因組上MTT1序列(圖3A),在不斷增加的巴龍霉素濃度下,基因組MTT1序列被LUC逐步替代.挑取在200μg/mL巴龍霉素下存活的B2086細胞株單克隆,擴大培養后提取基因組DNA進行PCR鑒定,陽性細胞株有2條擴增產物,750bp為四膜蟲大核基因組MTT1基因序列,2000bp為含有LUC基因序列(圖3A),結果表明LUC基因序列部分替代了大核MTT1基因序列,從而證實含有LUC的重組四膜蟲B2086-LUC構建成功.

圖3 四膜蟲pBX-LUC細胞株的鑒定Fig.3 Identification of Tetrahymena B2086-LUC strains

收集PCR鑒定為陽性的B2086-LUC細胞株并提取總蛋白,免疫印跡檢測HA-LUC蛋白的表達,結果顯示,HA-LUC蛋白分子量大小約為62.82kDa,與軟件預測分子量大小相符,而在未經重金屬誘導的細胞株中沒有出現任何特異性條帶(圖3B),表明HA-LUC蛋白在四膜蟲細胞內表達.

2.3 四膜蟲B2086-LUC對重金屬的監測

熒光素酶基因是一種重要的報告基因,在應激物誘導時表達產生螢火蟲熒光素酶,螢火蟲熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,在熒光素氧化的過程中,會發出生物熒光,然后可以通過熒光測定儀測定熒光素酶催化釋放的生物熒光.重組四膜蟲B2086-LUC對鎘誘導的響應濃度范圍為：0.001～0.5μg/mL,峰值為 19891 倍且對應的濃度為0.1μg/mL(圖4A);對汞誘導的響應范圍為：0.0005～0.2μg/mL,峰值為 1746 倍且對應的濃度為0.05μg/mL(圖4B);對銅誘導的響應范圍為：0.25～5mg/mL,峰值為2606倍且對應的濃度為2.5mg/mL(圖4C);對鋅誘導的響應范圍為：0.1～5mg/mL,峰值為19463倍且對應的濃度為2mg/mL(圖4D).結果說明以四膜蟲MTT1基因的啟動子啟動報告基因螢火蟲熒光素酶的表達,可以檢測多種應激物的表達,其中對非必需重金屬鎘、汞最敏感,銅和鋅次之.

3 討論

MT基因在環境中存在重金屬時的可誘導性使其可作為一種良好的報告基因.因此,MTs被歐盟列入生物標記物并用于環境評估項目中,其中一種途徑是直接檢測MT轉錄或蛋白表達水平,另一種有效途徑是將金屬誘導型啟動子組裝到報告基因前,從而構建一個新的轉基因生物用于發揮WCB的功能[14-15].類似于其他生物中,四膜蟲暴露在金屬環境中時MT基因被優先誘導表達[11,16].嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因MTT1啟動子能夠被多種重金屬離子誘導,因此能夠作為潛在的環境污染物的應答元件[9].

迄今為止,85%的用于檢測重金屬的WCBs是基于遺傳學改造的細菌[15],而15%是基于真核生物[17],分別是釀酒酵母、多形漢遜酵母及四膜蟲[5,18-19].大多數WCBs只能響應2種或多種金屬,而且有些表現出較強的特異性[20-22].其中以重組釀酒酵母為WCB可用于檢測樣品中的銅污染,最低可檢測到0.5μmol/L[19].以重組多形漢遜酵母為載體的WCB主要用于檢測環境中的有毒重金屬的污染,尤其是鎘污染[18].以四膜蟲為載體構建的WCB是通過基因重組將螢火蟲熒光素酶基因取代BTU2基因,并利用MTT1和MTT5基因啟動子的多重響應機制,在生長環境中含有重金屬等應激因素時,細胞能夠定量檢測環境中的污染指數,對非必需重金屬(鎘,鉛,砷和汞)的可檢測的最低濃度約為25～50nmol/L,而必須金屬(如銅和鋅)的可檢測的最低濃度約為1μmol/mL[5].本研究獲得的重組四膜蟲細胞株B2086-LUC對鎘、汞也表現出很強的響應,可響應的最低濃度為5～10ng/mL,與已報道的四膜蟲WCB的敏感性相近[5].但是本研究將LUC基因取代MTT1基因,而不是四膜蟲生長必需的微管蛋白,一方面削弱了MTT1原本的解毒反應,另一方面在不破壞四膜蟲微管正常發育的情況下,實現重組細胞株對重金屬鎘和汞的高敏感性.另外MTT1基因啟動子在細胞正常的生理狀態下,幾乎沒有轉錄產物的出現,而MTT2和MTT4在生理狀態下有較高的表達水平,因此MTT1基因啟動子的選擇有效的減少了熒光的背景信息.B2086-LUC細胞株對銅和鋅的響應稍弱,說明其對不同重金屬的誘導表現出差異,這與MTT1基因的啟動子對不同重金屬的敏感性一致.通過多次重復實驗證明了B2086-LUC細胞株的穩定性及對重金屬污染檢測結果的可重復性.

圖4 B2086-LUC四膜蟲細胞株對不同重金屬離子的響應Fig.4 The response to different heavy metal ions in Tetrahymena B2086-LUC cell

獲得WCB后用于檢測環境污染物,除了需要特定的基因外,它還依賴于測定介質和暴露于誘導物中的時間,以及細胞培養參數如培養濃度和生長階段等因素,因此建立標準化的操作是必需的.本研究中,重組四膜蟲B2086-LUC培養到對數生長期(2.0×105～5.0×105個/mL),饑餓在10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分裝,加入不同濃度的不同受測樣品誘導3h,這與已報道的四膜蟲WCB的檢測方法相似[5].WCB的一個潛在的缺陷是在檢測高毒性的樣品時,使細胞喪失生存能力并導致假陰性結果的產生,這些樣品不僅抑制誘導表達,也同時抑制了報告基因的本底表達,本研究通過稀釋樣品恢復本底和誘導反應,從而實現有效檢測.因此,系列稀釋誘導的WCB的熒光表達不僅可以用于檢測高毒性樣品引起的假陰性,還可以用于識別潛在的假陽性.本研究中的工程化細胞株基于MTT1基因的啟動子對一些重金屬離子(如鎘,汞)具有的偏愛性,因而具有特定的監測優勢.因此重組螢火蟲熒光素酶的四膜蟲B2086-LUC可望作為一種良好的環境污染監測工具用于環境中鎘、汞的快速監測.

4 結論

4.1 重組過表達載體pBX-LUC成功構建,其中含有LUC基因,MTT1基因啟動子,HA標簽,neo2抗性基因.

4.2 構建含有LUC的WCB重組四膜蟲B2086-LUC細胞株,LUC基因部分取代MTT1基因,在重金屬誘導下LUC蛋白特異表達.

4.3 B2086-LUC對重金屬鎘和汞的響應最敏感,可檢測的最低濃度為5～10ng/mL;對銅和鋅的響應較弱,可檢測的最低濃度為0.5～1mg/mL.

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致謝：重組四膜蟲的構建由王清路博士及梁海霞博士協助指導完成,在此表示感謝.