鹽度對MFC產電及其微生物群落的影響

羅 勇 ,駱海萍 ,覃邦余 ,劉廣立 *,張仁鐸

(1.江西省環境監測中心站,江西 南昌 330077；2.中山大學環境科學與工程學院,廣東 廣州 510275；3.廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室,廣東 廣州 510275)

在海洋食物制品行業、印染行業、石油天然氣行業和飲用水處理等工業處理過程中,都會產生大量的高鹽度廢水(＞2%W/VNaCl)[1-2].處理高鹽度廢水主要有物理、化學和生物技術,其中生物方法相對廉價且可以持續利用[3-5].然而,用生物方法處理高鹽度廢水時,高鹽度廢水會影響微生物的物理和生物化學性能,導致微生物細胞脫水,從而影響生物反應器的處理性能[6-7].

近年來微生物燃料電池(MFC)在污水處理領域受到了國內外廣泛的關注,尤其是其利用微生物為催化劑將廢水中的有機物轉化為電能的優點更是格外引人關注[8].自從2004年美國賓州州立大學Logan小組首次將單室MFC用于處理生活污水并取得較好效果之后[9],此后,各種各樣的實際廢水被用于MFC中.目前,MFC已被證明能夠處理多種高濃度有機廢水[9-11],如養豬廢水、生活污水和糠醛廢水等.然而,用 MFC去處理高鹽度廢水時,廢水中的鹽分很可能通過影響陽極燃料的氧化,電子傳遞以及微生物群落,從而影響MFC的性能.因此,研究鹽度廢水對MFC性能影響同時分析鹽度影響MFC的過程是很有必要[12],然而,迄今鮮見相關報道.

本課題組使用運行超過3個月的雙室MFC研究不同鹽度對MFC產電性能的影響,同時調查MFC陽極微生物能否忍受高鹽度廢水以及鹽度的變化是否會導致陽極微生物群落改變.

1 材料和方法

1.1 試驗裝置和材料

實驗使用的三個MFC反應器均由有機玻璃制成,其形態和結構與之前報道的類似[8].陰極室和陽極室的體積均為 18mL,兩極之間采用質子交換膜(Dupont,212)隔開.陰極采用50mmol/L鐵氰化鉀作為電子受體. 陽極材料和陰極材料均為碳毛刷纖維,其長寬分別為7 cm和3.6cm.外電路通過導線與插入陰陽極的碳纖維相連而構成回路,外電阻是1000?.陽極液和陰極液可通過恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司,BT12200)以流速為 20mL/min分別在陰陽室和陰陽極瓶(200mL棕色瓶)之間循環流動. MFC輸出電壓由DT85數據采集卡每隔30S采集一次.MFC始終保持在恒溫水浴鍋中[(30±1)℃].

1.2 MFC的接種與運行

本研究采用的3個MFC反應器,分別標記為 MFC-A、MFC-B和 MFC-C.從已穩定運行半年的MFC中接種微生物到三個MFC陽極中.此后,加入1000mg/L葡萄糖作為陽極基質運行所有 MFC,待所有 MFC獲得兩個穩定的電壓輸出周期后.在 MFC-A陽極基質中依次加入20,40,60,70g/LNaCl,在每個鹽度下運行至少 2個周期;在MFC-B中.在陽極基質中加入40g/L NaCl,在此鹽度運行至少2個周期;在MFC-C中,在陽極基質中直接加入 70g/L NaCl,同樣運行至少2個周期.

1.3 MFC陽極微生物的群落分析

MFC陽極微生物的群落分析過程如下,首先,使用FastDNA SPIN for Kit (MP BIO, IIIKirch,France)提取陽極電極上細菌的 DNA,并將提取后的 DNA 樣品放置在-20℃冰箱中保存.使用V3-2 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)和V3-3(5-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.)兩種引物從已提取的 DNA上去擴增 16S ribosomal DNA(rDNA). PCR的擴增液主要包括：17.37L dd H2O,2.5L 10′PCR Buffer,2.0L DNTP mixture,0.5L V3-2,0.5L V3-3,0.13L Taq polymerase和2L樣品.

PCR產物的DGGE分析在變形梯度凝膠電泳中進行,電泳液為20L左右的1×TAE,溫度設定為60℃.將點有PCR產物樣品的聚丙烯酰胺凝膠放入電泳槽內,在200mV電壓下電泳 6h.電泳結束后,將膠在濃度為 5μL EB/100mL 1×TAE的溶液避光染色20min,然后在紫外成像系統中拍照.

用手術刀把目的條帶從DGGE膠上切割下來,加入 20μL TE溶液,搗碎膠塊,在溫度為 50℃的水槽中,水浴 30min,然后以轉速為 12000r/min離心30s.取上清液5μL,用V3-1和V3-2為引物在25μL混合體系中進行PCR擴增. PCR產物送Invitrogen公司進行測序.測序結果與 NCBI用BLAST進行比對.

1.4 分析和計算方法

CODcr為標準分析方法[11].庫侖效率CE的計算如下[8]：

式中：M為氧氣的分子量,32g/mol;ti為時間;Ui為t時刻的電壓;b為每摩爾氧氣轉移的電子數;V為反應器容積;R為外電阻;F為法拉第常數96487C/mol;△S為COD的變化.

體積功率密度(PV, W/m3)計算如下：

2 結果

2.1 鹽度對MFC產電的限制

圖 1A為 MFC-A在不同鹽度下(0,20,40,60,70g/L NaCl)的11個產電周期.當陽極基質不含NaCl時,MFC的電壓迅速升高到 660mV,這表明在沒有NaCl的情況,陽極微生物能夠很快適應葡萄糖并對外輸出電能;當在陽極基質中加入20g/L NaCl后,最大輸出電壓輕微下降,從 660mV 下降到615mV;然而,當NaCl濃度從40g/L繼續升高,最大輸出電壓迅速下降,至70g/L NaCl時,最大輸出電壓僅有130mV(圖1A).在MFC-B中,當向陽極基質中直接加入40g/L NaCl后第一個周期,最大輸出電壓下降到 520mV,第二周期下降到300mV,此后,MFC沒有明顯的電能輸出(圖1B).在MFC-C中,當直接向陽極基質加入70g/L NaCl后第一個周期,最大電壓立刻下降到 260mV,此后,MFC沒有明顯的電能輸出(圖 1C).研究表明,NaCl可以明顯地限制MFC的產電,尤其是直接向陽極基質加入40,70g/L NaCl時.

圖1 分別加入不同濃度NaCl時,MFC的產電情況Fig.1 Electricity voltage outputs of the MFC with the different salinity of NaCl

2.2 不同鹽度下MFC的功率密度和庫侖效率

圖 2為陽極基質中 NaCl濃度為 0,40,70g/L時MFC-A的功率密度曲線.陽極基質的NaCl濃度為 0時,MFC的最大功率密度為34W/m3;當NaCl濃度為40g/L時,MFC的最大功率密度為 25W/m3;當 NaCl濃度提高到70g/L時,MFC 的最大功率密度為僅為1.4W/m3.NaCl的濃度也很明顯地影響 CE.從表1可知,NaCl的濃度為0時,MFC的CE高達 67%;當 NaCl的濃度從 0提高到 70g/L時,CE從67%下降到4%.

2.3 鹽度抑制后的MFC電能恢復

當陽極基質的 NaCl濃度為 70g/L時,MFC-A 無明顯的電能輸出.此時,停止添加NaCl以觀察MFC電能輸出是否會恢復.從圖3可以看出,停止添加NaCl后的第一個周期,MFC的輸出電壓可以在50h內緩慢地恢復到400mV,隨后下降到 50mV.更換新的基質后,輸出電壓能夠在 10h內迅速地升高到 630mV.結果表明,MFC產電性能即使受到高鹽度限制后也可以迅速地恢復.

圖2 陽極基質中NaCl濃度為0,40,70g/L時MFC-A的功率密度曲線Fig.2 Power density and cell voltage as a function of current density for the MFC-A with the salinity of 0, 40, and 70g/L NaCl

表1 MFC-A中CE與NaCl濃度的關系Table 1 The CEs as functions of the concentrations of NaCl in the MFC-A

2.4 鹽度變化下的陽極微生物情況分析

圖4是MFC-A在0g/L NaCl (A),40g/L NaCl(B),70g/L NaCl (C)以及再次不添加NaCl(D)時生物膜中主要細菌種類基因片段成像.圖 4中每條亮帶代表一個細菌種類,其亮度表示該細菌在微生物群落中的相對豐富度.當 NaCl濃度為 0(A)和 40g/L(B)時,Band 1和 Band 4明顯;然而,當NaCl濃度為70g/L時(C), Band 1和Band 4消失.此后,不再添加NaCl(D),Band 4再次出現且較亮度較高,但Band 1未出現,出現了Band 3,當NaCl為70g/L時,此亮帶消失.幾乎所有鹽度下都存在Band 2,但70g/L時亮度最大.

圖3 MFC-A的電能輸出被70g/L NaCl限制后的恢復情況Fig.3 Electricity recovery process after the MFC-A was inhibited by 70g/L NaCl.

圖4 NaCl濃度分別為0 (A),40 (B),70 (C),0g/L (D)時MFC-A的陽極DGGE圖像Fig.4 PCR-DGGE analysis of 16S rDNA extracted from the anode of the MFC-A with a salinity of 0 (A), 40 (B),70 (C), and 0g/L NaCl (D)

對亮帶進行 DNA序列測定后將結果與Blast進行比對,結果見表2.Band 1與Uncultured Bacteroidetes bacterium clone A21YG08RM small subunit具有 96%的同源性;Band 2與 Uncultured soil bacterium clone F3-266 16S ribosomal RNA gene 具有97%的同源性;Band 3和Band 4分別與16S rDNA sequence homology with Enterobacter cloacae subsp. dissolvens strain SDM 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 和 Shewanella sp. JC19 partial 16S rRNA gene, strain JC19展示了100%的同源性.這4個DNA條帶的序列在Gene bank的登錄號分別從HQ657324到HQ657327.

表2 不同鹽度下MFC-A生物膜上細菌16S rDNA 基因片段特性Table 2 Characterization of isolated 16S rRNA gene fragments derived from the electrodes of the MFC-A with different salinities

3 討論

在以往的研究中,關于 NaCl濃度對廢水生物反應器性能的影響存在一些爭議.有學者認為,在生物反應器加入少量的NaCl可以提高微生物的活性,但當 NaCl 的濃度超過了微生物的承受能力則會導致生物反應器性能下降[13-14].另有一些研究表明,高濃度的 NaCl 會限制生物反應器對有機物的去除[15-16],如 Windey 等[17]發現當NaCl的濃度達到30g/L時,生物反應器中微生物的活性下降 59%.在本研究中,不同的 NaCl濃度導致不同的結果,不同的 NaCl 濃度的添加方式也會導致不同的結果.如果直接將40g/L和70g/L NaCl加入到陽極液中,MFC運行幾個周期后就沒有電能輸出;但當NaCl濃度從20g/L逐步提高70g/L NaCl 后,MFC 依然有電能輸出.這一點從圖1A可知,加入 20g/L NaCl,最大輸出電壓下降10%,加入 40g/L NaCl,最大輸出電壓又下降了10%,即使在70g/L NaCl的情況下,MFC依然可以對外輸出電能.因此,逐步提升 NaCl濃度可以使MFC 更容易適應高鹽度,今后,培養和馴化耐鹽細菌將非常有利于MFC去除高鹽度廢水.

除了限制電能輸出,高鹽度同樣會影響MFC陽極微生物的群落及其多樣性.基于DGGE圖片(圖4)可知,當鹽度從0提高到40g/L時,陽極微生物群落結構變化并不明顯;但當鹽度繼續提高到70g/L 時,群落結構發生了明顯的變化,一些細菌如Enterobactersp. (Band 3)和Shewanella sp.(Band 4)很可能由于不能適應高鹽度而消失了.Wu 等[16]也認為鹽度很明顯地影響生物反應器的微生物群落結構,但 Lefebvre 等[18]卻發現NaCl濃度即使提高到120g/L,微生物群落結構也沒有明顯地變化. 兩位學者研究結果的差別可能是由于后者的生物反應器經過長期運行后,很多菌種已經適應了高鹽度的環境.

有報道表明,NaCl濃度大于 1%就很可能使微生物細胞脫水,從而限制其活性[19-20].但這種限制很可能是暫時的,在本研究中,高鹽度可以明顯地限制 MFC 陽極微生物的活性,但鹽度一旦解除了,MFC 的產電能力可以迅速恢復.這說明高鹽度僅僅是暫時限制了微生物的活性.

微生物脫鹽電池(MDC),由于其能夠去除有機物污染物、去除廢水的鹽度同時對外輸出電能[22],從而引起了國內外廣泛的關注.然而,MDC在脫鹽的過程中,越來越多的鹽離子進入陽極會導致陽極的鹽度迅速提升,鹽度的升高很可能會影響 MDC脫鹽和產電的性能.這些研究結果可以為研究高鹽度下MDC的性能提供一些依據.

4 結論

4.1 當向 MFC中依次添加 0,20,40,60,70g/L NaCl, MFC的最大輸出電壓從 660mV下降到130mV,同時庫侖效率也從 67%下降到 4%.這表明逐步添加 NaCl,即使鹽度高達 70g/L NaCl,MFC仍有電能輸出.

4.2 向 MFC(MFC-B 和 MFC-C)中直接添加40g/L和70g/L NaCl并運行兩個周期后,MFC無電能輸出,然而,停止添加 NaCl(鹽度解除)后MFC產電性能能夠迅速恢復.

4.3 當鹽度高于 40g/L NaCl時,陽極微生物群落發生明顯變化,一些不適應高鹽度的群種的優勢度下降,取而代之的是一些能夠適應高鹽度的菌種.

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