大黃中不同活性成分的綜合實(shí)驗(yàn)

劉小花，胡芳弟，李 文，封士蘭，南旭文，王海晴

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院本科09級(jí)，甘肅蘭州 730000）

大黃中不同活性成分的綜合實(shí)驗(yàn)

劉小花1，胡芳弟1，李 文1，封士蘭1，南旭文2，王海晴2

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院本科09級(jí)，甘肅蘭州 730000）

以甘肅道地藥材大黃為對(duì)象，研究其活性成分，充分利用蘭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心先進(jìn)儀器設(shè)備，改變僅以pH梯度萃取法提取分離大黃中蒽醌類化合物的現(xiàn)狀，將該基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)提升為綜合性實(shí)驗(yàn)。從而培養(yǎng)大學(xué)生的動(dòng)手能力、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力及理論與實(shí)踐的結(jié)合能力。同時(shí)實(shí)現(xiàn)教學(xué)與科研結(jié)合，達(dá)到以教學(xué)促進(jìn)科研，以科研激發(fā)教學(xué)的目的。

大黃；蒽醌衍生物；高效液相色譜；含量測(cè)定

綜合性實(shí)驗(yàn)是指由多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)任務(wù)組成，經(jīng)過(guò)系列的實(shí)施程序，最終得到某種結(jié)果的實(shí)驗(yàn)，該類實(shí)驗(yàn)需要體現(xiàn)多知識(shí)點(diǎn)或多學(xué)科的整合。蘭州大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化課程中實(shí)驗(yàn)二“大黃藥材的提取與分離實(shí)驗(yàn)”，要求學(xué)生掌握梯度pH萃取法和提取分離大黃中各種蒽醌苷元的原理及實(shí)驗(yàn)方法，了解蒽醌類化合物的顏色反應(yīng)及色譜檢查方法，這屬于專業(yè)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)。但該實(shí)驗(yàn)存在一些問(wèn)題：（1）屬驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生只需按規(guī)定的方法步驟完成，各門學(xué)科綜合知識(shí)得不到體現(xiàn)。（2）提取分離前學(xué)生僅從課本和教師講解中了解大黃藥材中含蒽醌類成分，沒(méi)有實(shí)驗(yàn)的感性認(rèn)識(shí)；（3）大黃藥材用梯度pH法進(jìn)行提取和粗分離，只能得到大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素3種化合物，其中大黃酚和大黃素甲醚是混合物，不能分開；（4）沒(méi)有化合物的純化和純度測(cè)定步驟，梯度pH法分離得到的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素3種化合物不純，但學(xué)生誤認(rèn)為是純品；（5）幾乎沒(méi)有使用任何精密的大型儀器。這樣的實(shí)驗(yàn)即不滿足天然藥物化學(xué)化實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求，也不符合高等學(xué)校培養(yǎng)精英人才宗旨，又浪費(fèi)藥材資源。所以我的將這種簡(jiǎn)單驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)改革為綜合性實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生們將所學(xué)的天然藥物化學(xué)、藥物分析學(xué)、現(xiàn)代色譜技術(shù)、中藥制劑分析學(xué)、波譜解析等多門課程的知識(shí)在實(shí)驗(yàn)中綜合應(yīng)用，提高了學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能。

1 大黃中蒽醌類化合物的提取分離實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）掌握梯度pH萃取法和提取分離大黃中各種蒽醌苷元的原理及實(shí)驗(yàn)方法；

（2）了解蒽醌類化合物的顏色反應(yīng)及色譜檢查方法。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理和主要內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)大黃中的蒽醌類甙元成分能溶于氯仿的性質(zhì)，采用氯仿提取，又利用羥基蒽醌類化合物酸性強(qiáng)弱不同，用pH梯度法進(jìn)行分離。具有羧基或多個(gè)β位酚羥基的蒽醌可溶于5%碳酸氫鈉溶液；具有一個(gè)β位酚羥基的蒽醌可溶于5%碳酸鈉溶液，只具有α位酚羥基的蒽醌，酸性弱，只溶于氫氧化鈉溶液。

以上是本科生試驗(yàn)的原理和主要內(nèi)容。本文中將大黃中蒽醌類化合物提取分離實(shí)驗(yàn)改革為綜合性實(shí)驗(yàn)——大黃中活性成分的研究。本項(xiàng)目用雙向酸水解法、梯度pH法和柱色譜法聯(lián)合應(yīng)用分離大黃中的活性成分，用MS、NMR法解析結(jié)構(gòu)，HPLC（高效液相色譜法）和UV（紫外分光光度法）測(cè)定大黃藥材中活性成分和單體化合物含量，比較2種方法差異，制備單體化合物對(duì)照品［1-4］；通過(guò)系統(tǒng)改進(jìn)，激發(fā)學(xué)生實(shí)踐學(xué)習(xí)的積極性，有利于學(xué)生動(dòng)手能力培養(yǎng)，儀器的認(rèn)識(shí)與操作，綜合思維與創(chuàng)新能力培養(yǎng)。

2 大黃中不同活性成分的研究綜合實(shí)驗(yàn)方案

2.1 大黃藥材的HPLC和UV含量測(cè)定比較

2.1.1 混合對(duì)照品溶液

分別精密稱取蘆薈大黃素1.67mg、大黃酸1.71 mg、大黃素0.68mg、大黃酚5.03mg、大黃素甲醚1.45mg，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液［5-6］。

2.1.2 供試品溶液

取樣品細(xì)粉約0.5g，精密稱定，加氯仿30mL，水10mL，濃鹽酸2mL，回流水解2h，冷卻，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿萃取4次，每次20mL，合并氯仿液，并回收氯仿，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0mL，搖勻，過(guò)0.45m的微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）柱（5μ，4.6mm×250 mm，迪馬公司生產(chǎn)）；流動(dòng)相：甲醇-1%醋酸，梯度洗脫，流動(dòng)相組成及流速見表1，進(jìn)樣10μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：430nm（大黃蒽醌衍生物）；柱溫25℃。該色譜條件下，5種成分的先后出峰順序分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，保留時(shí)間與對(duì)照品的保留時(shí)間一致，見圖1。

表1 流動(dòng)相組成

圖1 大黃HPLC色譜圖

2.1.4 色譜波長(zhǎng)確定

對(duì)供試品溶液在190～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明：蘆薈大黃素在430.4nm、大黃酸在431.6nm、大黃素在441.3nm、大黃酚在430.4nm、大黃素甲醚在435.2nm有最大吸收，故選擇430nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，見圖2。

圖2 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的紫外光譜圖

2.1.5 樣品的HPLC含量測(cè)定

照本文中所述色譜條件，三組學(xué)生對(duì)大黃藥材進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果mg／g

2.1.6 UV含量測(cè)定

根據(jù)圖2可知，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚這5種成分在430nm處均有吸收，故紫外的含量測(cè)定只能測(cè)到總蒽醌的量，不能測(cè)定每個(gè)部分的含量。學(xué)生1、2、3組分別測(cè)得的總蒽醌的量為16.39、22.34、16.53mg·g-1。

2.2 大黃中活性成分的提取分離

2.2.1 大黃中蒽醌甙元的提取

取大黃粗粉50g置于1 000mL圓底燒瓶中，加20%H2SO430mL，氯仿200mL，水浴回流1h，濾出浸液，藥渣再加20%H2SO430mL，氯仿200mL，水浴回流45min，濾出浸液，合并所得浸液，回收氯仿至剩余氯仿約100mL，用蒸餾水洗至pH6。

2.2.2 大黃酸的分離

上層氯仿液用5%NaHCO3溶液萃取4次，（80、60、40、40mL），合并NaHCO3液，用鹽酸中和至不再析出沉淀，析出棕黃色沉淀（若不出現(xiàn)沉淀，水浴上加熱）抽濾，水洗，70℃烘干，用少量冰醋酸重結(jié)晶，析出黃色針晶為大黃酸，抽濾烘干，稱重。

2.2.3 大黃素的分離

經(jīng)NaHCO3溶液提取過(guò)的氯仿液，繼用5% Na2CO3溶液萃取4次（80、60、40、40mL）。合并Na2CO3液，用鹽酸中和至不再析出沉淀，析出棕黃色沉淀（若不出現(xiàn)沉淀，水浴上加熱）抽濾，水洗，70℃烘干，用少量無(wú)水乙醇重結(jié)晶，析出橙色針晶為大黃素、抽濾，烘干，稱重。

2.2.4 蘆薈大黃素，大黃素甲醚和大黃酚混合物的分離

經(jīng)Na2CO3提取過(guò)的氯仿液，再用5%NaOH溶液提取4次（80、60、40、40mL），合并NaOH液，用鹽酸中和至不再析出沉淀，析出黃色沉淀，抽濾，水洗，70℃烘干，稱重。

2.2.5 蘆薈大黃素的分離

4得沉淀物溶于少量氯仿（約30mL），用0.25% NaOH溶液提取3次（20、10、10mL），合并提取液用鹽酸中和至中性，析出棕黃色沉淀，抽濾，70℃烘干，用少量乙酸乙酯重結(jié)晶，析出棕黃色針晶為蘆薈大黃素，抽濾，烘干，稱重。

2.2.6 大黃素甲醚和大黃酚混合物的分離

經(jīng)0.25%NaOH提取過(guò)的氯仿液再用5%NaOH提取3次（20、10、10mL），合并提取液，用鹽酸中和至中性，析出黃色沉淀，抽濾。水洗，70℃烘干，用少量乙酸乙酯重結(jié)晶，得大黃素甲醚和大黃酚混合物，抽濾，烘干，稱重。

2.2.7 大黃酚和大黃素甲醚的柱色譜分離

（1）薄層硅膠板的制備。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的羧甲基纖維素鈉（CMC—Na）水溶液，與薄層層析硅膠G粉，按3mL∶1g的比例配制調(diào)漿，以載玻片作為載體鋪板，鋪好后晾干，于105℃下活化1h，放人干燥器中，備用［7-12］。

（2）色譜柱的制備。取一根內(nèi)徑和長(zhǎng)度合適的玻璃層析柱，用洗脫劑濕法裝柱，用手輕敲柱子，使硅膠裝填結(jié)實(shí)且頂端平整，有效柱長(zhǎng)控制在20cm左右，硅膠用量為20g（工業(yè)級(jí)柱層析硅膠（100～200目）。

（3）樣品的制備。大黃酚和大黃素甲醚的混合物約（0.1g）用最少量的三氯甲烷溶解，再加入適量硅膠拌樣（約0.5g），待氯仿?lián)]發(fā)干后均勻鋪于柱頂。

（4）洗脫。以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（體積比100∶1∶0.5）為洗脫劑，進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮后可循環(huán)利用。

（5）色譜帶的定位。洗脫一定時(shí)間后可以看見兩段明顯的色譜帶，洗脫得快的那一段為大黃酚，較慢的那一段為大黃素甲醚。繼續(xù)洗脫，分別得到橙紅色顆粒狀結(jié)晶（大黃酚）和橙黃色針狀結(jié)晶（大黃素甲醚）。

（6）薄層色譜鑒定。取制備好的薄層硅膠板，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（體積比10∶1∶0.5）為展開劑，以對(duì)照品作對(duì)照，確定橙紅色顆粒狀結(jié)晶為大黃酚，橙黃色針狀結(jié)晶為大黃素甲醚。

2.3 純度測(cè)定

2.3.1 TLC薄層鑒別

（1）固定相：硅膠G板（青島海洋化工廠）；

（2）樣品：大黃藥材；大黃混合對(duì)照品；精制大黃酸；精制大黃素；精制大黃酚；精制大黃素甲醚；大黃素甲醚和大黃酚混合物；

（3）展開劑：石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）；

（4）顯色：可見光下觀察色斑，再于紫外燈（365 nm）下觀察熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖3。

圖3 大黃的薄層色譜鑒定

從下至上依次為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚的斑點(diǎn)Rf依次為0.087、0.127、0.187、0.527、0.587。

王定勇等研究發(fā)現(xiàn)大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素可以通過(guò)簡(jiǎn)單的pH梯度萃取法和重結(jié)晶得到單體，而大黃酚和大黃素甲醚在植物體內(nèi)常共同存在，它們結(jié)構(gòu)相似，酸性與極性相近，分離很困難，所以采用pH梯度萃取法得到大黃素甲醚和大黃酚混合物、再用柱色譜分離，得到純度較高大黃素甲醚、大黃酚的單體。大黃酸用冰醋酸、大黃素用無(wú)水乙醇、蘆薈大黃素用乙酸乙酯重結(jié)晶，大黃酸和大黃素得到單體（純度≥95%），而蘆薈大黃素部分產(chǎn)率太低，經(jīng)數(shù)次重結(jié)晶沒(méi)有拿到純度≥95%的單體，故沒(méi)有薄層色譜鑒定。

2.3.2 HPLC的純度測(cè)定（面積歸一化法）

使用上述色譜條件，檢測(cè)結(jié)果表明大黃酸純度為98.93%、大黃素純度為98.85%、大黃酚純度為98.66%，大黃素甲醚純度為99.74%，見圖4、圖5、圖6、圖7。

圖4 大黃酸的HPLC圖

圖5 大黃素的HPLC圖

圖6 大黃酚的HPLC圖

圖7 大黃素甲醚的HPLC圖

2.4 大黃酚和大黃素甲醚的結(jié)構(gòu)鑒別

（1）化合物Ⅰ為橙紅色顆粒狀結(jié)晶，熔點(diǎn)196～197℃。紫外光譜中在224nm、257nm、287nm、430 nm處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明是蒽醌類化合物。分子式為C15H10O4，其相對(duì)分子量M為254，EI-MS圖譜中m／z255為M＋1峰，證明化合物屬羥基蒽醌。化合物Ⅰ1H-NMR（CDCl3）數(shù)據(jù)如下：δ：2.46（s，3H，CH3），7.10（d，1H，C2-H），7.28（dd，1H，C7-H），7.82（dd，1H，C5-H），7.65（m，2H，C4-H、C6-H），11.99（s，1H，C1-OH），12.11（s，1H，C8-OH）；13C-NMR（CDCl3）δ：192.5（C9），181.98（C10），162.7（C1），162.4（C8），149.3（C3），136.9（C6），133.7（C11），124.5（C5），124.4（C2），121.3（C4），119.9（C7），113.7（C13），22.3（8Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的大黃酚數(shù)據(jù)一致，通過(guò)紫外、質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)的分析，確定化合物Ⅰ為大黃酚，結(jié)構(gòu)式如圖8（a）所示。

（2）化合物Ⅱ?yàn)槌赛S色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)202～204℃。紫外光譜中在224，265，286，435nm處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明是蒽醌類化合物。分子式為C16H12O5，其相對(duì)分子量M為284，EI-MS圖譜中m／z284為分子離子峰，證明化合物屬羥基蒽醌。化合物I的1HNMR（CDCl3）數(shù)據(jù)如下：δ：2.44（s，3H，CH3），3.48（s，3H，OCH3），6.67（s，1H，C2-H），7.07（d，1H，C7-H），7.26（S，1H，C4-H），7.35（m，1H，C5-H），12.09（S，1H，C1-OH），12.30（s，1H，C8-OH）；13C-NMR（CDCl3）δ：21.3（6位CH3），55.62（CH3O），190.8（9位C＝O），181.99（10位C＝O），113.7、110.26、121.27、124.49（4個(gè)蒽醌母核的CH），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的大黃酚數(shù)據(jù)一致，通過(guò)紫外、質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)的分析，確定化合物Ⅱ?yàn)榇簏S素甲醚，結(jié)構(gòu)式如圖8（b）所示。

圖8 化合Ⅰ和Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3 實(shí)驗(yàn)效果與討論

（1）增加高效液相色譜（HPLC）法和紫外（UV）法兩種方法測(cè)定大黃藥材中蒽醌類和單體化合物的含量，使學(xué)生熟悉藥物分析和中藥制劑分析中最常用的現(xiàn)代高效液相色譜儀的性能和使用方法，掌握HPLC法和UV法測(cè)定中藥中指標(biāo)成分的方法和原理的不同，HPLC法可以測(cè)到每一種成分的含量，但是UV法只能測(cè)到總蒽醌的量，同時(shí)還可能測(cè)定到其他雜質(zhì)，故UV法測(cè)得的含量比HPLC測(cè)得的含量高。

（2）用多種提取分離方法提取分離純化蒽醌類化合物，通過(guò)雙向酸水解、PH梯度萃取和柱色譜法聯(lián)合使用，使學(xué)生熟悉天然藥物化學(xué)中最常用的幾種分離純化化合物的操作方法，柱色譜上兩條明顯的色帶，直觀的展示了色譜原理。

（3）通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)分析單體化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)解析是歷屆藥學(xué)院學(xué)生在學(xué)習(xí)天然藥物化學(xué)課程和波譜解析課程中比較難的內(nèi)容，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生熟悉結(jié)構(gòu)解析過(guò)程和方法。

（4）增加純度測(cè)定方法，使學(xué)生掌握天然藥物化學(xué)課程的最基本的實(shí)驗(yàn)技能。

4 結(jié)語(yǔ)

綜合性實(shí)驗(yàn)可以是新的實(shí)驗(yàn)方法、技術(shù)或者對(duì)已有實(shí)驗(yàn)的改造和改良［15-16］。本綜合性實(shí)驗(yàn)涉及天然藥物化學(xué)、藥物化學(xué)、現(xiàn)代色譜、中藥制劑分析、藥物分析等多學(xué)科內(nèi)容，提高了學(xué)生的創(chuàng)新能力，給學(xué)生提供最大的自由空間，使他們能夠充分發(fā)揮自身的實(shí)踐能力：充分利用現(xiàn)代技術(shù)手段，使學(xué)生了解和應(yīng)用當(dāng)前新技術(shù)，牢固掌握所學(xué)的理論知識(shí)；培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力，激發(fā)學(xué)生利用新技術(shù)的興趣和將所學(xué)知識(shí)應(yīng)用于實(shí)際教學(xué)問(wèn)題的能力，充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性、積極性和創(chuàng)造性，提高了學(xué)生的分析問(wèn)題、解決問(wèn)題能力，促進(jìn)了學(xué)生的創(chuàng)新思維和實(shí)踐能力。各種大型儀器和小型儀器綜合使用，各門知識(shí)的綜合應(yīng)用，通過(guò)一系列系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)將一個(gè)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)打造成應(yīng)用型綜合性實(shí)驗(yàn)。

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Comprehensive experiment of different active compounds in Chinese rhubarb

Liu Xiaohua1，Hu Fangdi1，Li Wen1，F(xiàn)eng Shilan1，Nan Xuwen2，Wang Haiqing2
（School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

This article investigates the active compounds comprehensively with Chinese rhubarb which is the medicinal rubherb in Gansu Province，and considers to make full use of the resources of experimental center in School of Pharmacy of Lanzhou University，which can change the fact that is only based on the pH gradient extraction to separate the anthraquinones in rhubarb.Thus the basic experiment can be promoted to the comprehensive experiment，which can cultivate the abilities of practice，design experiments and the combination of theory and practice，stimulate the practical enthusiasm of the students，combine the teaching with scientific research，and get the aim that teaching can promote the scientific research and the scientific research can stimulate teaching.

Chinese rhubarb；anthraquinone derivatives；HPLC；content determination

R 965

A

1002-4956（2013）03-0047-05

2012-06-19

劉小花（1976—），女，甘肅蘭州，實(shí)驗(yàn)師，在職博士研究生，蘭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心副主任，研究方向：藥物分析學(xué)

E-mail：liuxiaoh＠lzu.edu.cn

封士蘭（1957—），女，陜西安康，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥中化學(xué)成份分離分析及中藥新藥研究工作.

E-mail：fengshl＠Lzu.edu.cn