小麥基因組原位雜交技術的影響因素分析

王小利，王軍衛

（西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 71210）

小麥基因組原位雜交技術的影響因素分析

王小利，王軍衛

（西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 71210）

采用切口平移法標記外源物種（黑麥）總基因組DNA作為探針，用受體物種總基因組DNA（中國春小麥）作遮蓋，對小麥1B／1R易位系中外源染色體的黑麥易位片段進行檢測。對影響基因組原位雜交技術實驗效果的因素進行了分析。通過實驗認為：細胞分裂相多、染色體分散良好、染色體長度適中的高質量染色體制片是取得理想實驗效果的基礎；保證在整個實驗過程中染色體一直附著在載玻片上不丟失是實驗進行的支撐條件；探針DNA與封阻DNA的比例是取得理想實驗效果的關鍵。對雜交信號過多或過少或者無雜交信號的技術環節進行了分析，并提出了解決辦法。實驗過程中應嚴格控制每一步驟，才能獲得理想的原位雜交實驗效果。

小麥基因組原位雜交；影響因素；切口平移法

1 基因組原位雜交簡介

基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）是20世紀80年代末發展起來的一種原位雜交技術。GISH是以來源不同的物種之一的總基因組DNA通過生物素、DIG、熒光素等標記物標記后做探針，在靶染色體上進行原位雜交雜種染色體制片上，而其他親本的基因組總DNA（或非探針的其他DNA）以一定的濃度比例來封閉雜種染色體上探針的非特異結合位點，盡可能使雜種染色體上的特異位點暴露出來供探針雜交。在封阻DNA和探針DNA之間，封阻NDA優先與一般序列雜交，剩下的特異序列主要被標記探針雜交，然后通過與該標記物耦合的熒光素免疫反應，檢測該親本染色體或染色體片段在雜種中的存在狀況［1-6］。

植物染色體基因組原位雜交技術是農林院校作物遺傳育種專業分子細胞遺傳學的重要實驗技術。該技術的興起與發展為遺傳學研究中檢測外源染色質，進行某一特定DNA序列或基因的染色體物理定位，研究異源多倍體物種中各染色體組間的部分同源關系，研究物種起源進化及物種間的親緣關系，以及分析導入不同核背景中的染色質的定位、行為、表達及結構等方面發揮了重要作用。

小麥的近緣屬種中蘊藏著豐富的有益基因是小麥遺傳改良的重要基因源之一。通過栽培小麥與近緣物種屬間遠緣雜交，結合染色體工程進行定向選擇，可將外源優良基因轉移到小麥中。而外源基因的有效轉移與利用，在很大程度上依賴于對導入小麥背景中的外源染色體或染色體片段的準確鑒定。目前，利用外源物種總基因組DNA作探針的GISH技術，已完全應用到小麥背景中大賴草、中間偃麥草、簇毛麥、東方旱麥草、新麥草、黑麥、長穗偃麥草、冰草等近緣植物的染色體或染色體片段的鑒定。同時，也利用物種專化DNA序列作探針的熒光原位雜交技術，鑒定了大量小麥近緣植物的染色體或染色體片段［7-10］。本文采用切口平移法標記外源物種總基因組DNA（黑麥）作為探針，用受體物種總基因組DNA（中國春小麥）作遮蓋，對小麥品系（小麥黑麥易位系）中外源染色體的易位片段進行檢測，系統介紹了本實驗技術的關鍵環節，對制備染色體、標記探針、探針與靶染色體的雜交以及對檢測雜交結果的過程中的影響因素進行了全面分析。

2 材料與方法

2.1 材料

封阻材料為中國春小麥，探針材料為小麥近緣植物黑麥，測試材料為小麥-黑麥易位系5-1。

2.2 方法

2.2.1 根尖染色體制片

將小麥-黑麥易位系種子消毒后用水浸泡24h，然后置于鋪有吸水紙的培養皿中（溫度為25℃）；當根長至1～2cm時取根尖于冰水中預處理22～24h，然后用卡諾固定液（95%乙醇與冰乙酸的比例為3∶1）固定2～3d；45%冰乙酸軟化5～10min，45%冰乙酸壓片；或用1%醋酸洋紅染色（無Fe），45%冰乙酸壓片；或者充分水洗后用1.5%纖維素酶和果膠酶處理2～3 h，45%冰乙酸壓片；用液氮或超低溫冰箱冷凍揭片后，放入45℃的45%冰乙酸3min，然后氣干；用相差顯微鏡觀察，選擇分裂相好的制片用于染色體原位雜交，-20℃干燥保存。

2.2.2 探針標記及封阻DNA的處理

將封阻材料（中國春小麥）和探針材料（黑麥）的種子消毒后用水浸泡12h，置于鋪有吸水紙的培養皿中（25℃），于黑暗條件下生長出黃化苗；用CTAB法提取易位系和中國春小麥DNA；基因組DNA經純化后用DIG-Nick Translation Mix（Roche，Germany）標記；把1μg模板DNA溶于16μL雙蒸水中，加入4μL DIG-Nick-Translation Mix混勻，離心，在15℃下反應90min后停止反應；加入1μL EDTA（0.5mol／L，pH 8.0）在65℃下放置10min，探針DNA的濃度為50mg／L，4℃保存備用。封阻DNA前用超聲波處理5min，或在沸水中煮40～50min。

2.2.3 探針DNA與封阻NDA雜交

將染色體制片在60℃干燥1h后，用RNaseA 37℃處理1h，2×SSC室溫清洗5min后晾干；用70%去離子甲酰胺70℃變性2～3min；然后分別在-20℃下預冷的70%、85%、95%、100%乙醇中各脫水5min，然后風干。封阻DNA與探針DNA的比例一般為50∶1，每個制片雜交液含100%甲酰胺20μL、20×SSC 4μL、50%DS 6μL、ssDNA（10mg／mL）1 μL，10%SDS 1μL、探針DNA（50mg／L）3μL和封阻DNA（500mg／L）5μL。以上雜交液混勻后在100℃水浴中變性10min，立即置于冰中2min；變性處理后的每張制片加40μL變性的雜交液，在60℃的用2×SSC潤濕的盒中溫育10min，然后放37℃雜交過夜；雜交完畢后脫去蓋玻片，依次在2×SSC室溫7min，30%去離子甲酰胺37℃10min，2×SSC 37℃7min，2×SSC室溫7min，1×PBS室溫7min中洗脫未雜交上的探針［11-13］。

2.2.4 熒光信號的檢測

經1×PBS洗過的制片上滴0.5～1mL的1× Blocking，15～25℃放置30min，吸去多余水分；吸50μL的anti-DIG溶液于載玻片上，蓋片，37℃放置60min（保濕）；在37℃下用漂洗緩沖液輕洗3次；吸50μL的anti-mouse-lg-DIG溶液于載玻片上，蓋片，37℃放置60min（保濕）；在37℃用漂洗緩沖液輕洗3次；吸50μL的anti-DIG-flourescein溶液于載玻片上，蓋片，37℃放置60min（黑暗，保濕）；在37℃用漂洗緩沖液輕洗3次，每次5min；用含適量PI的抗褪色劑封片（0.1μL PI＋25μL抗褪色劑）；最后用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡觀察原位雜交結果。在熒光濾色鏡U-MWIB2（激發波長460～490nm）下，FITC檢測的探針信號為黃綠色，經PI染色的其他染色體為紅色，因而，該檢測材料為小麥黑麥端部易位系。

3 結果與分析

3.1 染色體制片質量對原位雜交效果的影響

3.1.1 染色體分散狀況

染色體分散清晰、染色體互不重疊以及染色體長度形態良好的制片是小麥GISH技術效果好壞的基礎［14-16］。在實驗過程中要根據具體情況調整供試材料預處理和壓片過程，提高染色體分散狀況，以得到高質量的染色體制片。就小麥而言，在25℃條件下培養小麥種子容易獲得根尖分生區有絲分裂中期的細胞，溫度過高或過低都會影響根尖細胞的分裂；當根點長到1cm左右時，使根點處于4℃左右的水中進行預處理24h左右，時間太短，具有中期分裂相的細胞不多，時間太長染色體濃縮太短，影響雜交的分辨率。同時注意預處理水最好是自來水，可提供根尖一定的氧氣，有利于積聚更多的中期分裂相的細胞，可大大提高壓片的成功率。固定根尖的時間不要太長，以2～24h為宜，固定時間過短，根尖細胞很脆，細胞不容易分散，固定時間過長，染色體就容易模糊。可將固定好的根尖轉入70%乙醇中4℃保存，但保存時間不宜過長，一般不要超過1周。在壓片以前，注意一定要把根點細胞敲成霧狀，力度要適中，力度太小，細胞分散不開，力度太大，同一細胞的染色體不在一起或者染色體容易被敲碎，無法對染色體計數；壓片時，力度不可以太大，這樣染色體往往不容易分散（見圖1），可以用小力度多次壓片的方法使染色體不斷分散，每次從蓋玻片邊緣滲入45%乙酸，在酒精燈上微微加熱后輕輕壓片，往往可以獲得分散度良好的染色體制片。

圖1 分散不好的染色體制片

3.1.2 染色體濃縮度

影響GISH的因素之一是染色質的凝縮程度，濃縮度越高，分辨率和靈敏度就越低。就植物染色體制片而言，凝縮程度不同的靶DNA載體有有絲分裂中期染色體、減數分裂粗線期染色體、間期細胞核。有絲分裂中期染色體制片相對容易，仍可保持染色體的結構，如著絲粒、端粒和次繞痕，利于靶序列的定向和定位，它的染色體凝縮程度最高，分辨率和靈敏度最低。在染色體制片時，盡量選擇有絲分裂中期偏前的細胞，這樣的染色體比較細長一些，可適當提高GISH的分辨率。圖2顯示的小麥染色體雖然比較分散，也容易數清楚，但是作為原位雜交的染色體制片由于其染色體濃縮太短就不太適合。減數分裂粗線期染色體由于染色質凝縮程度降低，探針易于進入，所以檢測靈敏度也得到了一定程度的提高，顯示外源染色體的配對情況，明確外源染色體間同源關系，但染色體上不同區域分辨率有很大差別，異染色質區的分辨率依然不高。間期細胞核的染色質凝縮程度要明顯低于中期和粗線期染色體，間期細胞核染色質制片較容易，隨著染色質凝縮程度的降低，分辨率和靈敏度都有了很大程度提高，但也存在缺點，即不能確定信號相對于著絲粒、端粒和異染色質塊的位置和方向。為了彌補上述缺點，可將中期的雜交結果同間期相結合，或使用已知位置的DNA標記同未知DNA序列共定位，從而有利于目的基因的檢測。所以盡管GISH具有快速、直觀、操作簡便、不需分離特異性探針等優點，但它也有一定的局限性，單純用GISH無法確定外源染色體或染色體片段屬于哪個同源群、代換系所取代的特定染色體、易位系所發生的位置和斷點。

圖2 染色體濃縮太短

3.2 實驗過程中染色體易丟失

有時在檢測的過程中會出現染色體數目減少或者制片上細胞和染色體完全丟失（見圖3）。造成這種現象的原因有：因載玻片不干凈造成染色體固定不牢、壓片時根尖細胞未分散開使氣泡進入染色體制片、冷凍揭片時動作太慢或揭片時冷凍不足以至染色體隨蓋片被揭掉而造成染色體丟失。因此制片前載玻片要用鉻酸洗液浸泡，用自來水沖洗后，再用蒸餾水沖洗晾干，保證載玻片清潔；壓片時一定要使根尖細胞均勻分散在蓋玻片與載玻片之間，染色體制片做好之后應及時在液氮中冷凍，防止冰乙酸揮發氣泡進入蓋玻片與載玻片縫隙；在液氮中冷凍時間稍長一些，一般為3～5 min，揭片時動作盡可能迅速，揭片以后讓制片充分干燥，有利于染色體在載玻片上的附著。另外染色體制片在雜交和沖洗過程中，力度太大也可以造成染色體丟失。

圖3 染色體丟失

3.3 封阻DNA對雜交效果的影響

所檢測外源染色體基因組與背景材料基因組之間同源性越遠，由交叉雜交現象（探針DNA與小麥染色體DNA之間發生雜交）所造成的干擾越小，外源染色體越容易檢測；所檢測外源染色體基因組與背景材料基因組之間同源性越近，則由交叉雜交現象所造成的干擾越大，外源染色體越難檢測。也就是說外源染色體基因組與背景材料基因組之間同源性遠近在一定程度上影響著GISH實驗的效果。封阻是指非檢測染色體DNA，其作用是除去探針、染色體中的相同序列，使其不能和非檢測染色體雜交。由于同源序列首先雜交，因而可阻止探針DNA與非特異性位點雜交或非目標DNA雜交，封阻DNA也可通過空間隔離防止探針DNA與相似DNA雜交。所以當基因組探針與未標記的封阻DNA結合使用時，可很好地區分目標DNA和非目標DNA。加入封阻DNA對于親緣關系較近物種的鑒別是必須的，GISH中無論是探針還是封阻都必須通過染色體的立體結構來完成雜交，所以其長度必須有利于在染色體的立體結構中穿梭，將被檢測材料的對照（中國春小麥）的總DNA剪切成大約250bp片段后，不加任何標記且過量加入雜交混合液，能夠提高探針DNA雜交的特異性。目前常用的DNA剪切法有超聲波剪切法、煮沸法、高壓剪切法、微量注射器反復抽提法等。通過瓊脂糖電泳檢測片斷大小，研究表明DNA長度在200～500bp最有利于雜交，有效地封阻非特異性位點。

3.4 雜交信號過多或過少或者無雜交信號

3.4.1 雜交信號過多

造成雜交信號過多的原因之一是封阻DNA不足，導致探針在非目標DNA上產生較多的非特異性雜交，因而顯示許多弱的非特異性雜交信號（見圖4）。探針與封阻DNA的比例根據不同供試材料之間基因組同源關系遠近而差異較大，因此在雜交時需要的封阻DNA的量也不相同，小麥與黑麥染色體有75%相同的序列，而在檢測小麥中的黑麥染色體時，需要用約50倍于探針濃度的未標記小麥gDNA作封阻。造成雜交信號過多的另外一個原因是雜交后洗脫強度不足。洗脫的目的主要是去掉非特異性雜交信號，洗脫強度不足時，會增加非特異性雜交信號，因此實驗過程中要根據不同情況仔細摸索洗脫條件，如洗脫液離子濃度、洗脫溫度及洗脫時間，并嚴格控制洗脫條件。此外，所檢測的外源染色體所在的基因組與背景材料染色體所在的基因組同源關系較近也容易造成雜交信號過多，這是由于交叉雜交現象造成的。實驗過程中為避免交叉雜交現象的影響應嚴格控制洗脫條件及洗脫強度。必須注意的是漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而增強了背景染色。實驗過程中配制試劑時要使用質量高的去離子水，在洗脫環節時操作要快，盡量減少雜質污染。

圖4 雜交信號太多

3.4.2 雜交信號過少

造成雜交信號過少（見圖5）的原因之一是雜交不充分。在雜交過程中雜交時間稍長一些實驗效果相對好一些，雜交溫度應嚴格控制在36～38℃范圍內。造成雜交信號過少的另外一個原因是封阻DNA過量。過量的封阻DNA與目標DNA雜交，只有少量與封阻DNA完全不同源的目標DNA與探針雜交，產生較少的雜交信號。出現這種情況可以通過適當減少封阻DNA來改進實驗效果。造成雜交信號過少還有一個原因是雜交后洗脫強度過大，洗脫的目的主要是去掉非特異性雜交信號，洗脫強度過大時，部分特異性雜交信號也被洗脫掉，因此實驗過程中要根據不同情況仔細摸索洗脫條件并嚴格控制洗脫條件。另外，PI的濃度過大或者染色時間太長，或者染色后洗脫強度不夠，多余的PI遮蓋了雜交信號，也會造成雜交信號的減少。

圖5 雜交信號太少

3.4.3 無雜交信號

GISH實驗最不理想的結果就是無雜交信號（見圖6）。造成這種現象的原因：一是DNA未變性；二是探針未標記上。在麥類作物原位雜交實驗過程中采用高溫變性一般不存在未變性問題，但溫度過高、時間過長會影響染色體的形態；探針未標記上的原因主要是gDNA質量和標記溫度造成的。在用切口平移法對黑麥總DNA進行標記之前，必須對總DNA進行剪切，以適合DnaseⅠ／DNA聚合酶Ⅰ作用大小（大約10～12kb）。要產生這種長度的DNA片段，可以用劇烈的旋渦振蕩，反復凍融，超聲處理或用直徑細小的針抽擠DNA。也可用切口平移時加長DnaseⅠ酶解消化時間或增加DnaseⅠ的濃度。另外還有的是實驗材料無目標染色體，這可能是一些遠緣雜交后代分離時部分植株外源染色體丟失。

圖6 無雜交信號

4 結論

本實驗以小麥1B／1R易位系為實驗材料，對影響GISH技術實驗效果的因素進行了分析。通過實驗認為：細胞分裂相多、染色體分散良好、染色體長度適中及無雜質影響的高質量的染色體制片是取得理想實驗效果的基礎；檢測的外源染色體所在的基因組與背景材料基因組同源關系的遠近以及探針DNA濃度與封阻DNA濃度的比例是取得理想實驗效果的關鍵；保證在整個實驗過程中染色體一直附著在載玻片上不丟失是實驗進行的支撐條件。麥類作物GISH實驗技術中操作步驟較多、操作過程比較繁瑣、影響因素較多，因此在實驗過程中應嚴格控制每一步驟，才能獲得理想的原位雜交實驗效果。

（References）

［1］張維銘.現代分子生物學實驗手冊［M］.北京：科學出版社，2003.

［2］張正斌.小麥遺傳學［M］.北京：中國農業出版社，2001.

［3］鐘冠昌，穆素梅，張正斌.麥類遠緣雜交［M］.北京：科學出版社，2002.

［4］陳佩度.作物育種生物技術［M］.北京：中國農業出版社，2001.

［5］劉進元.分子生物學實驗指導［M］.北京：清華大學出版社，2002.

［6］李懋學，張贊平.作物染色體及其研究技術［M］.北京：中國農業出版社，1996.

［7］關鶴，趙泓，云興福.基因組原位雜交技術在植物研究中的應用［J］.分子植物育種，2006，3（4）：99-105.

［8］裴冬麗，李鎖平.原位雜交技術在植物研究中的應用［J］.河南農業科學，2004（2）：7-9.

［9］榮紅穎，張曉東，郭新梅.植物熒光原位雜交技術的發展及在基因工程育種中的應用［J］.分子植物育種，2007，5（增刊）：89-96.

［10］別同德，張伯橋，高德榮，等.DNA分子原位雜交（in situ hybridization）在植物分子細胞遺傳學研究中的應用［J］.中國農學通報，2008，24（11）：85-89.

［11］王靜，王獻平，紀軍，等.小麥-黑麥1R／1BL新易位系的創制和分子細胞遺傳學鑒定［J］.作物學報，2006，32（1）：30-33.

［12］茹巖巖，張學勇，李大勇，等.對基因組原位雜交信號釋譯可能出現的片面性：來自一個小麥易位系（A-3）中外源遺傳物質鑒定的啟示［J］.作物學報，2002，28（1）：6-10.

［13］武軍，馬琳，趙繼新，等.普通小麥：華山新麥草矮稈種質B62的分子細胞學鑒定［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2010，38（12）：123-126.

［14］周榮華，孔秀英，李培，等.植物基因組原位雜交中部分問題的探討［J］.農業生物技術學報，1997，7（2）：109-112.

［15］林小虎，李興鋒，王黎明，等.麥類作物體細胞基因組原位雜交（GISH）效果影響因素的分析［J］.實驗生物學報，2005，38（2）：126-129.

［16］顧愛俠，李雪姣，馮大領，等.基因組原位雜交中封阻DNA制備方法研究［J］.河北農業大學學報，2010，33（5）：77-79.

Analysis on influencing factors wheat genome in situ hybridization

Wang Xiaoli，Wang Junwei
（Agronomy College，Northwest Agriculture and forestry University，Yangling 712100，China）

The genome in situ hybridization（GISH）is an ideal technology of the direct detection of target DNA in the nucleus in the presence and distribution，which particularly facilitates in the identification exogenous chromosomes or chromosome segments of additional lines，substitution line，translocation lines genetic material and genome composition of allopolyploid species.By nick translation labeled exogenous species（rye）total genomic DNA as a probe，with receptor species total genomic DNA（China Spring Wheat）as a cover，exogenous chromosomes of rye translocation fragments was detected in 1B／1Rwheat translocation lines，the key experimental technology links of GISH technology were introduced，and influencing factors were analyzed.Experiments show that（1）the high quality chromosome preparation is the foundation of obtaining the ideal experimental effect with phase cell，chromosome，chromosome length of well dispersed with moderate；（2）that chromosome has been attached to the slide，which may not lose the supporting conditions during the whole experiment process；（3）the ratio of probe DNA to blocking DNA is key of obtaining the ideal effect；（4）technical links to hybridization signals too little or too much or no hybridization signal were analyzed.Every step should be strictly controlled in order to obtain the desired effect in situ hybridization experimental process.

wheat；genome in situ hybridization（GISH）；influencingfactor

S512.1

A

1002-4956（2013）03-0039-05

2012-06-25

國家自然科學基金項目（30971844）

王小利（1967—），女，陜西華縣，博士，高級實驗師，農業生物技術實驗室主任，主要從事小麥分子細胞遺傳學研究和農業生物技術實驗室管理工作.

E-mail：nwwangxl＠126.com