鄰苯二甲酸丁基芐酯對小鼠學習和記憶能力的影響

劉鋒明,劉旭東,閔安娜,趙莉琴,葉染楓,李 慧,張玉超,陳明清,楊 旭(華中師范大學生命科學學院,環境科學實驗室,湖北 武漢 430079)

鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)是鄰苯二甲酸酯類化合物PAEs的一種,是70種環境激素之一[1],被美國國家環保局(EPA)列為優先控制污染物[2].由于其加工性能、耐油性、耐污染性好,在工業中廣泛運用,普遍存在于城市污泥及大氣中[3-4].所以說鄰苯二甲酸丁基芐酯對人和動物的暴露事實上是難以避免的,它可以通過飲食、口鼻吸入、皮夫接觸、醫療暴露等途徑進入人和動物體內,其中,經飲食進入體內是最主要的途徑[5-6].研究表明,鄰苯二甲酸丁基芐酯具有生殖毒性和發育毒性[7].暴露高劑量的BBP可以導致肝、腎損害,引起癌癥的發生,導致胎兒畸形和死亡.鄰苯二甲酸酯被認為是具有環境雌激素效應的內分泌干擾物,可以通過母體血液,經過胎盤或乳汁干擾胎兒或新生兒的內分泌系統,影響生殖功能和器官的發育[8].此外,BBP光解水解及揮發速率較慢,對人和動物體有長期的影響.并可能改變正常的大腦發育[9].評價鄰苯二甲酸酯的毒性及其致病機制是當前的研究熱點之一.特別是鄰苯二甲酸酯被認為是一種內分泌干擾物,它的生殖毒性和發育毒性引起了人們廣泛的重視,并得到了很多動物毒理學及流行病學調查研究的支持[10-12].然而BBP對神經系統特別是對大腦的影響卻鮮有文獻報道.Hidetoyo等[13]較早就比較了BBP、鄰苯二甲酸正二己酯(DNHP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(BLP)等物質對新生鼠小腦神經細胞和神經膠質細胞的生長的影響,但這是在離體的條件下進行的,對于BBP通過口暴露后能否克服體內的血腦屏障而造成對腦組織的損傷還是不清楚的.

因此,本研究通過檢測BBP對小鼠學習和記憶的影響、海馬組織的氧化損傷水平來評價BBP的神經毒性.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本研究所用的動物為鼠齡3周左右的SPF級雄性昆明小鼠,體重23～33g,購自湖北省實驗動物中心.實驗動物飼養在華中師范大學實驗動物中心,每天12h光照/12h黑暗,允許自由進食和飲水.

1.1.2 主要試劑與儀器 鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP),(Sigma 公司,純度＞99%),2’,7’—二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma公司,純度＞97%),硫代巴比妥酸(TBA,國藥集團化學試劑有限公司),5’,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB 分析純,國藥集團化學試劑有限公司).其他試劑均為國產分析純.低溫冷凍離心機(Eppendorf-5415R),電熱恒溫水箱,渦旋器,全波長酶標儀(Bio-teck),熒光酶標儀(Bio-teck).

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒方法 將24只雄性昆明小鼠隨機分成4組,每組6只,分別標記為對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組,分別對應體內染毒濃度為0,50,250,1,250mg/(kg·d)BBP[14].將 BBP:吐溫 80體積比1:1用生理鹽水配制成125mg/mL的染毒母液,使用時按照比例稀釋成5,25,125mg/mL的染毒液進行實驗.染毒組每天清晨使用灌胃針按照0.01mL/g體重的灌胃比例灌注相應濃度的染毒液,對照組按照同樣比例灌注生理鹽水,連續染毒11d.實驗小鼠每天除染毒和行為學實驗外,其他時間均飼養于實驗動物中心,12h光照/12h黑暗,允許自由進食和飲水.

1.2.2 Morris水迷宮實驗 如圖1所示,水迷宮實驗主體裝置由一個直徑120cm、高50cm、內壁不反光的不銹鋼圓形水池組成,置于燈光布局合理,與外界相對隔絕的實驗室中央.迷宮池以根據東西南北4個等距點將水池假想地等分為4個象限,分別記為SW、SE、NW及NE象限.在SE象限的正中距離池壁30cm處放置一直徑為9.5cm、高25cm的黑色平臺,淹沒于水下1cm.水溫控制在25℃.實驗期間保持周圍環境恒定.實驗時,根據具體采用的實驗方案選擇恰當的水點,抓取小鼠,使其面向池壁,在水平面高度將其輕放入水中,讓其自由游泳.其游泳軌跡被迷宮上方的攝像機記錄并傳入計算機,由AnyMaze軟件記錄分析.

圖1 Morris水迷宮實驗裝置示意Fig.1 Experimental system ofMorris water maze

Morris水迷宮測試分為定位航行實驗和空間探索實驗2部分.其中,定位航行實驗主要檢測小鼠的學習能力,前11d的實驗中,每天染毒完畢6h后開始進行游泳訓練.將小鼠分別從4個象限中向水池放入,并開始記時錄像,記錄小鼠60s內找到平臺的時間,該時間也就是小鼠的逃避潛伏期.在前11d時,若小鼠在1min內未找到平臺,則由實驗者用手將其引導上平臺,讓其在平臺上停留60s,目的在于讓其觀察四周,學習定位平臺位置.通過了前11d的定位航行學習過程后,再經過2d的遺忘期,在第14d對小鼠進行空間探索實驗.拆掉平臺,以同樣方法進行水迷宮實驗,由軟件記錄60s內小鼠在各象限內游泳的時間以及跨越平臺位置的次數.通過記錄小鼠在移除平臺后的水迷宮各個象限的游泳時間和游泳軌跡,分析得到小鼠對實驗環境的空間記憶能力的強弱.

1.2.3 懸尾實驗 懸尾實驗基于Steru等[15]建立的方法.將實驗動物尾部固定,使其頭部向下懸掛,動物在該環境中拼命掙扎,企圖擺脫困境,在經過努力仍不能擺脫后,出現間斷性不動,顯示“行為絕望”狀態.該實驗采用懸尾計算機實時檢測分析處理系統進行“不動時間”測試.

1.2.4 強迫游泳實驗 此實驗在Porsolt[16]建立的方法上做了一些改進.將動物單獨地放在柱狀塑料桶中(水深 l5cm,直徑 20cm),水溫(25±1)℃.強迫游泳6min,用攝像機記錄小鼠游泳的全過程,然后采用AnyMaze軟件分析并記錄小鼠的“不動時間”(不動即“小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態,四肢有輕微動作以保持頭部在水面”).

1.2.5 組織勻漿的制備 14d的染毒及行為學實驗結束后,將小鼠脫頸處死,迅速取出腦、肝、腎各組織,至于冰上,稱重并記錄后,將左右半腦一分為二,取小鼠的左半腦置于4.0%的多聚甲醛固定過夜,用于大腦海馬組織切片;剩余的右半腦同肝和腎一樣,使用勻漿器于冰上加PBS制成濃度為10%的組織勻漿.將組織勻漿液于4℃、5000r/min,離心10min,收集上清液冷凍保存,進行ROS、GSH和MDA含量的測定.

1.2.6 氧自由基(ROS)水平的測定 組織勻漿中ROS水平的測定使用的是DCF熒光法[17].將10mmol/L的DCFH-DA熒光染料用PBS緩沖液稀釋1000倍,將待測腦組織勻漿液并用PBS稀釋2倍,肝腎組織勻漿稀釋10倍后,各取100μL混勻,在37℃下避光保存10min后,測量其在480nm激發光,520nm發射光下的熒光強度.

1.2.7 丙二醛(MDA)含量的測定 MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[18].取10mL試管,每管加入0.5mL待測樣品液,調零管加入0.5mLPBS,然后各管加入2mL 0.6%TBA溶液,混勻后沸水浴15min,取出后流水冷卻.10000r/min,離心10min,取上清液分別在450,532,600nm波長下測定吸光值,按照公式C=6.45(D532-D600)-0.56D450,計算出每管樣品中MDA的濃度(C)[19](μmol/L).

1.2.8 還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測 GSH的含量采用熒光染料DTNB來測定[20].取200μL細胞勻漿上清,加入50μL濃度為10%的TCA,混勻.10000r/min,離心5min.然后取50μL上清加入酶標板,再加150μL,60ng/mL的DTNB室溫避光5min,測定412nm波長下的吸光值.

1.2.9 小鼠大腦海馬組織切片分析 將置于4.0%的多聚甲醛固定過夜的腦組織.第2d送武漢谷歌生物科技有限公司做HE染色大腦海馬組織切片;最后,顯微鏡觀察、拍照.

1.2.10 統計學分析 用Origin6.1軟件作圖,SPSS17.0軟件對實驗數據進行ANOVA分析,兩兩比較采用LSD檢驗法檢驗染毒組與對照組之間的差異.

2 實驗結果

2.1 小鼠體重的變化

實驗染毒過程中,小鼠每天自由進食和飲水,小鼠的體重也會發生變化.圖2統計小鼠每天體重的變化及最后1d與第1d小鼠體重的凈變化.從圖2A中可以看出,小鼠的體重逐漸增加.從圖2B中可以知,染毒組小鼠體重的緩慢增加,但是染毒組和空白對照組小鼠體重并沒有顯著性的變化.

2.2 水迷宮實驗

從圖3中可以看到,在第14d的實驗中,對照組小鼠在平臺所在象限(SE象限)所停留的時間明顯多于其他象限,而BBP染毒組的小鼠在平臺所在象限停留的時間較少.同時,用SPSS17.0軟件統計分析各組小鼠在平臺所在象限停留時間之后得出,1250mg/(kg·d)劑量染毒組的小鼠與對照組相比,有顯著性差異(*P＜0.05).結果說明通過學習,對照組小鼠獲得了很好的記憶能力,而BBP染毒組小鼠的記憶能力則受到了不同程度的損傷.

圖2 小鼠體重的變化及凈增長量Fig.2 The net growth and change of the weight in mice

圖3 小鼠空間探索實驗結果Fig.3 The results of mouse space exploration experiment

圖4 實驗第14d空間探索實驗中小鼠游泳軌跡Fig.4 mice swimming trajectories of space exploration experiment

由圖4可見,對照組小鼠游泳路徑具有很強的目的性和方向性,主要集中在SE象限即原平臺所在象限,而BBP染毒組小鼠游泳路徑大多是不規則的、無目的性的.

2.3 懸尾實驗

以50mg/(kg·d)的染毒劑量時,小鼠的懸尾不動時間明顯高于空白對照組(*P＜0.05),在1250mg/(kg·d)的高劑量濃度時小鼠的懸尾不動時間相對于空白對照組出現極顯著差異(圖5).

圖5 懸尾實驗Fig.5 Tail suspension test of mice

2.4 強迫游泳實驗

與小鼠懸尾實驗結果不同的是,在1250mg/(kg·d)的高劑量濃度時小鼠的不動時間對比與空白對照組才出現顯著性差異(*P＜0.05),而50mg/(kg·d)的染毒劑量時無顯著性的差異,如圖6.

圖6 小鼠強迫游泳實驗Fig.6 Forced swimming test of mice

2.5 BBP對小鼠腦、肝、腎組織中ROS水平的影響

從圖7中可以看出,隨著BBP染毒濃度的增加,小鼠腦、肝、腎組織中ROS水平也逐漸上升,在腦組織中高劑量組1250mg/(kg·d)BBP染毒組與對照組相比具有顯著性差(*P＜0.05).在肝和腎組織中在250mg/(kg·d)BBP染毒組與對照組相比具有顯著性差異,在高劑量組1250mg/(kg·d)BBP染毒組與對照組相比具有極顯著性差異(**P＜0.01).結果說明,BBP能夠使小鼠腦、肝和腎組織中活性氧含量水平上升,并且隨著BBP濃度的增大,ROS水平上升越明顯.

圖7 BBP染毒對小鼠各組織中ROS含量的影響Fig.7 Changes of ROS concentrations after administration by BBP

2.6 BBP對小鼠腦、肝、腎組織中MDA含量的影響

圖8 BBP染毒對小鼠各組織中MDA含量的影響Fig.8 Changes of MDA concentrations after administration by BBP

從圖8中可以看出,隨著染毒濃度的增加,小鼠腦、肝、腎組織中MDA含量逐漸上升,并且經過統計分析,1250mg/(kg·d)BBP染毒組與對照組相比,具有顯著性差異(*P＜0.05),說明BBP能夠對小鼠腦組織產生了脂質過氧化,并且隨著BBP濃度的增大,氧化損傷程度越高.

2.7 BBP對小鼠腦、肝、腎組織中GSH含量的影響

從圖9中可以看出,隨著染毒濃度的增加,小鼠腦、肝、腎組織中GSH含量逐漸下降.并且經過統計分析,腦組織中在250mg/(kg·d)BBP時染毒組與對照組相比,具有顯著性差異(*P＜0.05),而肝和腎在1250mg/(kg·d)BBP的高濃度染毒組相比對照組,才出現顯著性差異(*P＜0.05).說明BBP能夠對小鼠腦、肝、腎組織產生了氧化自由基,并且隨著BBP濃度的增大,氧化損傷程度越高,消耗的GSH的量也更多.

圖9 BBP染毒對小鼠各組織中GSH含量的影響Fig.9 Changes of GSH concentrations after administration by BBP

2.8 BBP對小鼠大腦海馬區細胞的影響

李文英等[21]認為,在獲得新信息方面海馬結構完整性對于學習記憶至關重要[22].經BBP染毒后,小鼠大腦海馬區細胞相比與對照組出現不同程度的凋亡,隨著染毒濃度的逐漸增大,出現凋亡的細胞也逐漸增多,如圖10.結果表明,BBP染毒對小鼠的海馬細胞有一定程度的損傷,進而影響了小鼠的學習和記憶能力.

圖10 小鼠大腦海馬區HE染色組織切片Fig.10 Tissue sections of mouse brain hippocampus

3 討論

在本研究中,小鼠Morris水迷宮定位航行實驗中,BBP染毒組的小鼠在平臺所在象限停留的時間較少,特別是1250mg/(kg·d)高劑量染毒組的小鼠與對照組相比,有顯著性差異(*P＜0.05).結果表明BBP染毒組小鼠的記憶能力則受到了不同程度的損傷.空間探索實驗游泳路徑顯示,對照組小鼠游泳路徑具有很強的目的性和方向性,而BBP染毒組小鼠游泳路徑大多是不規則的、無目的性的.懸尾實驗和強迫游泳實驗結果表明染毒小鼠的不動時間明顯高于空白對照組.這些結果表明經過灌胃暴露BBP的小鼠學習記憶能力受到了影響.

氧化損傷是引起機體細胞衰老、損傷、凋亡、死亡的重要原因.已有研究認為DEHP、DBP、BBP等鄰苯二甲酸酯都能導致氧化損傷[23-24].王婧等[25]對離體大鼠肺細胞進行BBP染毒,結果表明BBP對大鼠肺細胞有著明顯的毒性作用,能使其發生氧化損傷.由于BBP所引起的氧化損傷作用較弱,在DEHP、DBP、BBP等3種鄰苯二甲酸酯中所引起的氧化損傷作用最弱.并且BBP進入腦組織對腦神經細胞造成損傷還要突破腦血屏障,因此BBP能否對活體動物腦組織造成氧化損傷還是不清楚的.本研究結果顯示BBP能夠使小鼠腦組織中活性氧含量水平上升,特別是在高劑量組1250mg/(kg·d)BBP染毒組與對照組相比具有顯著性差(*P＜0.05).MDA檢測表明BBP能夠對小鼠腦組織產生了脂質過氧化,并且隨著BBP濃度的增大,氧化損傷程度越高.GSH檢測顯示BBP染毒小鼠隨著染毒劑量的升高,腦組織中GSH含量逐漸下降.因此,可以認為BBP可以引起小鼠腦組織的氧化損傷.

李文蘭等[26]的研究認為鄰苯二甲酸丁基芐酯在動物血清、腸道被代謝成鄰苯二甲酸單丁酯及鄰苯二甲酸甲丁酯.那么是進入腦組織對腦細胞造成損傷的到底是BBP還是他的代謝產物鄰苯二甲酸單丁酯和鄰苯二甲酸甲丁酯,它們是否有相同的神經毒性作用;有待進一步的研究.

4 結語

一定濃度的BBP染毒會導致小鼠的腦、肝、腎組織損傷,尤其是大腦海馬區的損傷,會引起小鼠學習與記憶能力的減弱,說明BBP對小鼠具有一定的氧化損傷毒性和神經毒性.

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