Vip3A殺蟲蛋白隨機重組文庫的構(gòu)建與分析

張寧 劉榮梅 束長龍 張杰 李海濤 高繼國

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為革蘭氏陽性菌，Bt在芽胞的形成過程中能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），這種伴胞晶體蛋白對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等多種重要的害蟲都有特異性的毒殺作用。1996年，Estruch等［1］在Bt發(fā)酵上清液中發(fā)現(xiàn)了營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs）。VIPs與Bt在芽胞形成的過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白的同源性極低。VIPs分為Vip1、Vip2、Vip3和Vip4，其中尤其Vip3A 蛋白對鱗翅目夜蛾科害蟲（如小地老虎、草地貪夜蛾、甜菜夜蛾和棉鈴蟲等）具有廣譜高效的殺蟲活性［2］。其中Vip3Aa蛋白間的氨基酸序列同源性都在95%以上，但其序列間個別氨基酸的差異也會導致對害蟲毒力和殺蟲譜的變化［3］。本試驗采用的Vip3Aa39和Vip3Aa11蛋白氨基酸序列間僅存在39個位點的不同，但Vip3Aa39和Vip3Aa11對小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲的殺蟲活性差別較大，根據(jù)本實驗室生物活性測定，Vip3Aa39對小地老虎的50%致死濃度（LC50）為5.43 μg/mL，而Vip3Aa11的LC5073.62 μg/mL；Vip3Aa39對小菜蛾的LC50為140.64 μg/mL，而Vip3Aa11對小菜蛾的殺蟲活性極低；Vip3Aa11對棉鈴蟲LC50為35.18 μg/mL，而 Vip3Aa39 的LC50僅 為 286.99 μg/mL［6］。 所 以定位和分析Vip3A蛋白的功能特異性區(qū)域，對研究Vip3Aa蛋白的殺蟲活性及殺蟲譜具有重要意義。

現(xiàn)在，人們越來越關注對已有蛋白質(zhì)的基因改造，發(fā)明了多種蛋白質(zhì)突變體基因庫構(gòu)建方法［4］，其中就包括同源及非同源的多種重組方法。本研究選用了本實驗室克隆的對小菜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲生物活性不同的vip3Aa39［6］和vip3Aa11［7］基因為目的基因，將兩個基因片段進行同源隨機重組，得到一系列同源重組產(chǎn)物。將不同的重組產(chǎn)物利用Gateway［5］技術克隆到供體載體（Donor vector），構(gòu)建一個Vip3A的隨機重組文庫。旨在獲得高毒力、具有殺蟲特異性的Vip3A蛋白的同時，也為進一步研究Vip3A類蛋白高毒力及殺蟲特異性相關功能區(qū)域奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39的Rosetta（DE3）菌株和轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pET28a-Vip3Aa-11的BL21菌株為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物技術組實驗室所有。pDONR221菌株購于Invitrogen公司。Escherichia coliJM109為實驗室保存菌。

1.1.2 主要試劑和工具酶 Gateway BP Clonase Ⅱ E-nzyme Mix購自Invitrogen公司；2×TaqPCR Master-Mix、DNA Ladder Marker購自博邁德生物公司；PrimerSTAR Max DNA Polymerase 購自大連寶生物公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR純化試劑盒購自AxyPrep生物技術有限公司。PCR引物合成和測序委托上海生工生物工程有限公司。DNA marker：100 bp ladder plus 購自博邁德生物公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純以上或進口超級純產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體LB：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%。固體LB：在液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取 利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取大腸桿菌中的質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39、pET28a-Vip3Aa11和pDONR221。

1.2.2 重組目的基因的引物設計 根據(jù)已得到的vip3Aa39、vip3Aa11序列和attB1、attB2位點序列，設計引物。由于attB位點序列過長，設計兩步PCR。各引物名稱及序列如下：VIP3AA39-5：GTACAAAAAAGCAGGCTATGAATAAT；VIP3AA39-3：TTACTTAATTGAGACATCGTTAAACTTTACAAGA；VIP3AA-11-5：ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGCACAAGA；VIP3AA11-3：GTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATAGAGACATCGT；attB1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT（下劃線為attB1、attB2的部分序列）。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以pEB-Vip3Aa39，pET28a-Vip3Aa11質(zhì)粒為模板，利用已設計引物 VIP3A-A39-5、VIP3AA39-3 和 VIP3AA11-5、VIP3AA11-3進行第一步PCR，分別在vip3Aa39基因的5'端加上attB1位點的部分序列，在vip3Aa11基因的3'端加上attB2位點的部分序列，且引物之間的長度為整個基因的完整序列；再分別以第一步PCR產(chǎn)物為模板，利用引物attB1、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、attB2，進行第二步PCR，分別使vip3Aa39基因的5'端加上attB1全位點序列，使vip3Aa11基因的3'端加上attB2全位點序列。

提取載體pDONR221質(zhì)粒，將第二步PCR反應產(chǎn)物attB1-Vip3Aa39和Vip3Aa11-attB2分別用PCR純化試劑盒進行純化，最后用 Gateway BP重組試劑盒中的Gateway BP ClonaseⅡenzyme mix 2 μL 進行25℃［8］過夜重組反應，獲得重組質(zhì)粒。重組反應示意圖見圖1。

1.2.4 Vip3A隨機重組文庫的構(gòu)建 重組質(zhì)粒加入2 μL蛋白酶K，37℃溫浴10 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取所有克隆。

1.2.5 陽性克隆的鑒定 將重組質(zhì)粒進行PCR初步鑒定，測序由中國農(nóng)業(yè)科學院重大科學工程開放實驗室完成。根據(jù)測序結(jié)果，確定陽性克隆子。

2 結(jié)果

2.1 vip3Aa的PCR反應

圖1 Gateway技術同源重組示意圖

以質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39和pET28a-Vip3Aa11為模板，應用引物VIP3AA39-5、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、VIP3AA11-3擴增到帶有部分attB1位點的vip3Aa39的目的產(chǎn)物和帶有部分attB2位點的vip3Aa11的目的產(chǎn)物，結(jié)果見圖2中1、2、3、4泳道。將PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化后，結(jié)果見圖2中6、7泳道。

圖2 vip3Aa39和vip3Aa11的第一步PCR擴增及純化檢測

以第一次PCR反應產(chǎn)物為模板，進行第二次PCR，結(jié)果（圖3）顯示，應用設計引物attB1和VIP3AA39-3成功得到帶有attB1全位點的vip3Aa39目的產(chǎn)物（圖3中1、2泳道），命名為attB1-vip3Aa39；應用設計引物VIP3AA11-5和attB2成功得到帶有attB2全位點的vip3Aa11目的產(chǎn)物（圖3中3、4泳道），命名為vip3Aa11-attB2。

圖3 vip3Aa39和vip3Aa11的第二步PCR擴增檢測

應用NanoDrop ND-1000核酸蛋白定量檢測儀，對純化后的PCR產(chǎn)物及提取的pDONR221質(zhì)粒進行定量：attB1-vip3Aa39濃度為189.6 ng/L，vip3Aa11-attB2濃度為193.2 ng/L，pDONR221濃度為76 ng/L，結(jié)果顯示，濃度能夠達到Gateway BP重組試劑盒的要求。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和重組文庫的確定

將初步鑒定的42個重組質(zhì)粒進行測序。將測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)站上的BLAST、Informax 2003 Vector NTI Suite 9、DNAMAN等軟件分析，獲得22個氨基酸序列不同的重組突變體，從而確定重組文庫。

對Vip3Aa39、Vip3Aa11和22個突變體氨基酸序列差別位點進行統(tǒng)計，結(jié)果（圖4）顯示，有的突變體與Vip3Aa39的序列N端區(qū)別很大，有的與Vip3Aa11序列的C端差別很多，但都與Vip3Aa39和Vip3Aa11的氨基酸序列不同，并且這些突變體在Vip3Aa39和Vip3Aa11的39個氨基酸差異位點上都有體現(xiàn)。說明重組位點覆蓋了兩個材料基因的全部差異位點，并且重組位點的數(shù)目有一個由逐漸遞增到遞減的趨勢，為之后研究材料基因的功能特異位點奠定了很好的基礎。同時將22個突變體氨基酸序列到NCBI網(wǎng)站進行蛋白序列比對，得到的每個突變體都是新序列。

將得到的22個突變體氨基酸序列和vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列應用Vector NTI軟件進行聚類分析，可看出各個突變體與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的遠近關系，結(jié)果（圖5）顯示，距離vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列較遠的突變體，其氨基酸序列與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差別較大，例如M1、M20、M21和M22，共4個突變較大的突變體，占總突變體的18%；反之，突變體的氨基酸序列與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差別較小，例如M2和M12等。

圖4 氨基酸突變位點統(tǒng)計分析

圖5 Vip3A突變體氨基酸序列聚類圖

3 討論

目前國際上的同源重組方法主要包括DNA shuffling［9］、StEP［10］、RACHITT［11］、RETT［12］、NExT［13］、Golden Gate Shuffling［14］。這 6 種方法中，有的存在酶的消化條件難于控制，有的存在片段延伸時間難于控制等問題，步驟繁瑣，都制約了重組的成功率。本研究采用Gateway技術及同源重組酶，步驟簡單，只需一步重組反應，且反應條件易于控制，在25℃條件下就可進行重組，成功率高。利用Gateway技術，擺脫了傳統(tǒng)載體構(gòu)建中酶切連接的局限性。Gateway入門載體兩端的接頭不同，能夠很好地解決目的基因連入的方向問題，未成功重組的載體由于仍然具有致死基因ccdB，而使普通大腸桿菌無法生長從而減少了假陽性的菌株，為后期的篩選工作節(jié)省了時間。

現(xiàn)在，人們主要應用Gateway技術的BP、LP反應來構(gòu)建表達載體，例如2011年，徐品三等［15］應用Gateway技術快速構(gòu)建百合雙價抗病毒RNAi表達載體；闕文忠等［16］利用Gateway技術快速地構(gòu)建同時表達NK4蛋白和綠色熒光的重組腺病毒；李明等［17］采用Gateway克隆技術構(gòu)建了小麥TaWRKY46-1基因可誘導型超量表達載體；本研究利用同源重組酶對兩個2.3 kb的全長基因進行同源隨機重組，然后再通過由Invitrogen公司開發(fā)的Gateway［5］技術將不同的同源重組片段克隆到其供體載體上，構(gòu)建突變體文庫。利用此方法進行的同源隨機重組，重組位點能夠覆蓋全部材料基因，重組材料及條件易于控制，操作簡單；同時利用Gateway技術的BP重組反應將重組片段克隆到供體載體上，省去了普通克隆時的酶切連接鑒定的繁瑣步驟，可直接將片段克隆到載體上，極大地提高克隆效率。

本研究運用Gateway重組酶通過對Vip3A類兩個基因的隨機重組獲得了22個突變體，經(jīng)氨基酸序列比對，差異較大的序列，說明突變位點較多，這可能會改變原有目的基因的功能；差異較小的序列，為今后定向研究材料基因的功能區(qū)域提供了研究對象。基于這些突變體在氨基酸序列上呈現(xiàn)的差異，我們將對這些突變體基因在大腸桿菌中進行重組表達，然后對每個突變體重組蛋白進行提取，并將其對鱗翅目昆蟲如甜菜夜蛾、小菜蛾、小地老虎等進行生物活性測定，以期找到殺蟲特異性強，殺蟲譜廣的殺蟲蛋白。為研究Vip3A蛋白的特異性相關區(qū)域或氨基酸定位奠定基礎，具有重要的理論意義和實用價值。

4 結(jié)論

應用Gateway技術中的BP反應對殺蟲譜存在特異性的vip3Aa39和vip3Aa11基因進行同源重組突變，構(gòu)建重組文庫。獲得42個基因型不同的重組質(zhì)粒，其中有22個蛋白序列不同的突變體。

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