土茯苓中鞣質提取工藝的優化

任玉蘭，彌春霞，張啟律，游 佳，李曉玲

（牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江157011）

土茯苓，又名冷飯團、硬飯團、山牛、禹余糧、山遺糧、赤土茯苓、光葉菝葜等，為百合科多年生常綠攀緣狀灌木，多生于山坡或林下，分布于我國安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、四川、云南省等，是北方傳統的清熱解毒中藥。土茯苓具有抗腫瘤、抗脂質過氧化、保護缺血心肌、免疫抑制、抗兒茶酚胺及抗動脈粥樣硬化等藥理作用，可用于治療梅毒、淋濁、腳氣、疔瘡、冠心病、心絞痛、麻疹、急性細菌性痢疾和急慢性腎炎等［1］，對汞有一定解毒作用［2］，還具有增強機體免疫作用，其抗腫瘤作用與鞣質含量有密切關系［3］。

鞣質又稱單寧或鞣酸，是存在于植物界的一類結構比較復雜的多元酚化合物，具有收斂、抗菌、抗病毒、解毒、降壓、驅蟲、清除體內自由基、抑制神經系統、降低血清中脲素氮含量、抗炎等多種功能。

目前，土茯苓生藥學研究比較完善，但對土茯苓中有效成分的提取研究較少。鑒于此，作者通過單因素實驗和正交實驗對土茯苓中鞣質的提取工藝進行優化，擬為土茯苓的開發應用提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

土茯苓：產自安徽，購于牡丹江市某藥店。

丙酮、濃氨水、乙酸鋅、氯化銨、乙二胺四乙酸鈉、濃鹽酸、鉻黑T、冰乙酸、三乙醇胺、鞣質，均為分析純。

SHB－3型循環水真空泵，鄭州杜甫儀器廠；HS－11.6型電熱恒溫水浴鍋，山西交水醫療器械廠；TB－214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；RE－52A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 土茯苓中鞣質的提取流程

土茯苓干樣→粉碎→稱量→加入適量丙酮溶液→回流提取→減壓過濾（取濾液）→減壓蒸餾→含量測定。

1.3 提取工藝的優化

固定其它條件，分別考察丙酮濃度、料液比、提取溫度、提取時間對鞣質提取量的影響；然后在單因素實驗的基礎上，選擇提取溫度、丙酮濃度、料液比、提取時間為考察因素，以鞣質提取量為考核指標，進行正交實驗，以優化土茯苓中鞣質的提取工藝。

1.4 鞣質提取量的測定［4，5］

用移液管準確移取20.00mL 1mol·L－1的乙酸鋅溶液于500mL容量瓶中，加入14mL飽和氨水，搖勻使白色沉淀完全溶解；將經回流提取的鞣質水溶液加蒸餾水稀釋到400mL，于水浴鍋中加熱至（35±2）℃，然后定量移入該容量瓶中，并不斷振搖，再置于恒溫水浴鍋中（35±2）℃溫熱約30min（間歇振搖數次），取出，冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用干濾紙過濾。

精密吸取濾液25.00mL于500mL錐形瓶中，加蒸餾水300mL、氨－氯化銨緩沖溶液（pH＝10）25mL、鉻黑T指示劑少許，搖勻后用濃度為0.05mol·L－1的EDTA標準溶液滴定，當溶液由紫紅色變為藍色即為滴定終點，用空白校正。按下式計算鞣質提取量（mg·g－1）：

式中：0.1556為每毫升1mol·mL－1的乙酸鋅溶液平均消耗鞣質0.1556g；V0為空白對照消耗EDTA標準溶液的體積，mL；V為樣品消耗EDTA標準溶液的體積，mL；cEDTA為EDTA標準溶液的濃度，mol·L－1；m為土茯苓樣品質量，g。

2 結果與討論

2.1 土茯苓中鞣質的定性實驗

將提取液分別與稀鹽酸、溴水、三氯化鐵、石灰水、乙酸鉛、甲酸和香草醛等在試管中進行定性反應，結果見表1。

表1 土茯苓中鞣質的定性實驗結果Tab.1 Qualitative experiment results of tannin fromSmilax glabra Roxb.

鞣質可分為水解鞣質和縮合鞣質。由表1可知，土茯苓中含有鞣質，且基本為水解鞣質。

2.2 單因素實驗

2.2.1 丙酮濃度對鞣質提取量的影響（圖1）

圖1 丙酮濃度對鞣質提取量的影響Fig.1 Effect of acetone concentration on tannin extract

由圖1可知，隨著丙酮濃度的增加，鞣質提取量先升高后降低，當丙酮濃度為50%時，鞣質提取量達到最大。因此，選擇丙酮濃度為40%、50%、60%進行正交實驗。

2.2.2 料液比對鞣質提取量的影響（圖2）

由圖2可以看出，隨著料液比的減小（即丙酮溶液用量的增大），鞣質提取量先升高后降低，當料液比為1∶20（g∶mL，下同）時，鞣質提取量達到最大。因此，選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20進行正交實驗。

2.2.3 提取溫度對鞣質提取量的影響（圖3）

圖2 料液比對鞣質提取量的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on tannin extract

圖3 提取溫度對鞣質提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin extract

由圖3可以看出，隨著提取溫度的升高，鞣質提取量先升高后降低，當提取溫度為60℃時，鞣質提取量達到最大。因此，選擇提取溫度為50℃、60℃、70℃進行正交實驗。

2.2.4 提取時間對鞣質提取量的影響（圖4）

圖4 提取時間對鞣質提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on tannin extract

由圖4可以看出，隨著提取時間的延長，鞣質提取量先升高后降低，當提取時間為90min時，鞣質提取量達到最大。因此，選擇提取時間為60min、90min、120min進行正交實驗。

2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果，選擇提取溫度、丙酮濃度、料液比、提取時間為考察因素，以鞣質提取量為考核指標，進行L9（34）正交實驗，以優化提取工藝。正交實驗的因素與水平見表2，結果與分析見表3。

表2 正交實驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交實驗結果與分析Tab.3 Result and analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表3可知，各因素對土茯苓鞣質提取量的影響大小依次為：提取溫度＞料液比＞提取時間＞丙酮濃度，即影響最大的因素是提取溫度，影響最小的是丙酮濃度。土茯苓的最佳提取條件為A3B1C2D2，即提取溫度70℃、丙酮濃度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取時間90min。

2.4 精密度實驗與加標回收率實驗

稱取10g土茯苓于5個250mL圓底燒瓶中，加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90 min，抽濾后測定濾液中鞣質提取量。結果見表4。

稱取10g土茯苓于5個250mL圓底燒瓶中，向各燒瓶中加入1mL鞣質標液，再加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90min，抽濾后測定濾液中鞣質提取量。結果見表4。

表4 精密度實驗與加標回收率實驗結果Tab.4 Results of the precision experiment and the standard addition recovery experiment

由表4可以看出，在優化的提取工藝條件下，土茯苓中鞣質的提取量為20.77mg·g－1，回收率為99.90%，方法可靠，重現性好。

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗確定土茯苓中鞣質的

最佳提取工藝為：提取溫度70℃、丙酮濃度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取時間90min，在此條件下，土茯苓中鞣質提取量為20.77mg·g－1。該提取工藝經濟可行，方法的精密度高、重現性好。

［1］張存莉，劉虎岐，傅建熙.藥用植物土茯苓研究進展［J］.陜西林業科技，1999，（3）：60－63.

［2］徐笑飛，陳紅風，葉媚娜.土茯苓解汞毒的研究概況［J］.中國中藥雜志，2012，37（6）：750－753.

［3］張穎，張立木，丁靜，等.土茯苓中單寧含量的測定［J］.泰山醫學院學報，2004，25（3）：212－213.

［4］王家棟，于興博.正交實驗法優選榛子葉中鞣質的超聲提取工藝［J］.黑龍江醫藥，2009，22（3）：313－314.

［5］馬彥梅，龔曉武，李炳奇.正交試驗優化沙棗果肉中鞣質的超聲提取研究［J］.食品研究與開發，2012，33（2）：58－60.