VPA聯合As2O3對NB4細胞VEGF及Survivin表達的影響*

王陶然，張志華，王麗紅，趙 蕾，郝長來

(承德醫學院附屬醫院血液病科，河北承德 067000)

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是FAB分型中的M3型急性白血病，骨髓中以顆粒增多的早幼粒細胞為主，以往APL的治療效果很差，預后兇險，多因并發彌散性血管內凝血(DIC)或原發性纖維蛋白溶解導致嚴重出血，造成早期死亡[1]。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)可通過誘導分化和促進癌細胞凋亡達到治療目的，是治療APL有效、安全的藥物，具有骨髓抑制輕等優點，尤其適用于對維甲酸耐藥的難治病例。但在臨床治療過程中發現，As2O3治療早期可以誘導分化階段的白細胞急劇增長，白血病細胞的浸潤增加了病人治療的危險性。有學者認為，白血病細胞浸潤現象與小劑量的As2O3能使APL細胞株(NB4)細胞分泌更多的血管內皮生長因子(VEGF)有關。Survivin基因是近年發現的一種抑制凋亡的新基因，屬于凋亡蛋白抑制家族(IAP)成員。研究發現，Survivin與血管生成密切相關[2]。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是臨床上廣泛應用的廣譜抗癲癇藥，近年的研究發現，VPA屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有抑制組蛋白去乙酰化酶活性的作用，可阻礙血管生成、抑制轉移，從而達到治療腫瘤的目的。本研究以NB4細胞為研究對象，觀察VPA聯合As2O3對NB4細胞VEGF及Survivin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 NB4細胞株，由中國醫學科學院血液學研究所王建祥教授惠贈。VPA，美國Sigma公司，用滅菌注射用水稀釋，-20℃冰箱密閉避光保存，臨用前用不含血清和抗生素的RPMI 1640液稀釋至所需濃度。

1.2 細胞培養 NB4細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，同時加入青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100U/mL)，37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗分組 將NB4細胞懸液調整為1×105/ml，接種于培養瓶，每瓶10ml。實驗組分別加入As2O30.1μmol/L、As2O30.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L，對照組不加藥。

1.4 NB4細胞VEGF和Survivin mRNA表達的檢測 采用RTPCR法檢測VEGF和Survivin mRNA的表達。收集不同藥物處理48h的NB4細胞，按Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，取適量DEPC水溶解沉淀，用紫外分光光度計在260nm和280nm處測A值，OD260/OD280為1.8-2.0，根據A260值計算RNA濃度。按逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用VEGF、Survivin和β-actin引物進行PCR擴增。VEGF上游引物:5’-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3’， 下游引物:5’-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3’，產物大小409bp;Survivin上游引物:5’-CTTTCTCAA GGACCACCGCATC-3’，下游引物: 5’CAATCCATG GCAGCCAGCTGC-3’，產物大小393bp;β-actin上游引物:5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGG -3’，下 游引物:5’- AGGGGCCGGACTCGTCATACT -3’，產物大小621bp。PCR反應條件:預變性95℃ 5min、變性95℃45s、退火58℃ 1min、延伸72℃ 1min，38 個循環，終延伸72℃ 8min。取PCR產物行2%瓊脂糖凝膠(含0.5mg/L溴化乙錠)電泳，80V、電泳30-50min，凝膠成像系統照相，圖像分析系統檢測吸光度(A)值，與β-actin擴增產物的A值進行比較，計算目的mRNA相對表達量。

1.5 統計分析 采用SPSS 17.0統計學軟件處理數據，多組間采用方差分析及LSD-t檢驗。

2 結果

半定量RT-PCR分析顯示，As2O30.1μmol/L組NB4細胞VEGF mRNA的表達明顯高于對照組、Survivin mRNA的表達明顯低于對照組(P＜0.05);與As2O30.1μmol/L組比較，As2O30.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L 組NB4細胞VEGF mRNA、Survivin mRNA的表達均明顯降低(P＜0.05)。見附表。

附表 NB4細胞VEGF和Survivin mRNA的表達(±s)

附表 NB4細胞VEGF和Survivin mRNA的表達(±s)

與對照組比較:*P＜0.05，與As2O3組比較:#P＜0.05

組別 VEGF mRNA Survivin mRNA對照組 0.268±0.010 0.927±0.010 As2O3 0.1μmol/L組 0.456±0.026* 0.832±0.049*As2O3 0.1μmol/L+VPA 1.0mmol/L組 0.254±0.009# 0.337±0.054#

3 討論

APL是一種特殊的髓細胞性白血病，具有獨特的細胞形態學和生物學特征，因早期出血傾向嚴重，易并發DIC及原發性纖溶亢進導致病死率較高。As2O3是治療APL安全、有效的藥物，在臨床上取得了良好的治療效果[3]。但As2O3具有早期誘導分化階段白細胞急劇增長的作用，白血病細胞的浸潤增加了病人治療的危險性。如何減輕As2O3的毒副作用而不影響其療效，是臨床工作者和科研人員面臨的一個重要課題。聯合用藥、多靶點治療是腫瘤防治的一個新策略，有效的聯合用藥不但可增強對腫瘤的療效，而且能通過減少單個藥物的劑量降低藥物的副作用。

有研究表明，白血病細胞浸潤現象與VEGF有關，小劑量As2O3在誘導NB4細胞凋亡的同時還能使其分泌更多的VEGF[4]。本研究亦證實了這一點，0.1μmol/L的As2O3作用于NB4細胞48h后，與對照組相比，VEGF mRNA的表達明顯升高、Survivin mRNA的表達明顯降低。VEGF表達增加不僅促進白血病細胞自身的增殖，還可刺激血管內皮生長、促進血管生成，為腫瘤細胞生長提供有利條件和骨髓微環境[5]。因此推測，小劑量As2O3誘導細胞凋亡的同時還伴有一定程度的誘導細胞增殖和浸潤的作用。Survivin基因是目前已知作用最強的抑制蛋白，具有抗凋亡、促進細胞增殖、血管生成等功能，被認為是抗腫瘤藥物的新靶點[6]。Survivin是一個在血管形成過程中表達于內皮細胞的保護基因，不僅可以抑制腫瘤細胞的凋亡，而且可抑制腫瘤血管內皮細胞的凋亡，VEGF在腫瘤細胞中高表達，不僅直接促進血管的形成，還可誘導Survivin表達，產生抗凋亡作用，導致血管過度增生。二者共同作用，促進血管形成，從而促進腫瘤的發生發展[7]。

VPA是一種廣泛應用于臨床的古老的抗癲癇藥物，近年的研究發現，VPA具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)的作用。VPA作用于腫瘤細胞時，可阻滯腫瘤細胞的細胞周期并誘導腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞自我吞噬。此外，VPA還能夠抑制腫瘤血管生成，使腫瘤細胞因缺血、缺氧而死亡，從而延緩腫瘤生長和抑制腫瘤轉移[8]。本研究結果顯示，VPA聯合小劑量As2O3可以降低單獨應用As2O3導致的NB4細胞VEGF表達的升高、并進一步降低Survivin的表達，表明As2O3聯合VPA具有降低As2O3不良反應，加強As2O3促凋亡和抗血管新生的作用。本研究對臨床提高應用As2O3治療APL患者的療效，探討聯合治療具有重要意義。

[1]Park JH, Qiao B, Panageas KS, et al.Early death rate in acute promyelocytic leukemia remains high despite all-trans retinoic acid[J].Blood, 2011, 118(5):1248-1254.

[2]Yang M, Liu Y, Lu S, Wang Z, et al.Analysis of the expression levels of survivin and VEGF in patients with acute lymphoblastic leukemia[J].Exp Ther Med, 2013, 5(1):305-307.

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