胸腹水癌細胞形態學檢驗診斷的實踐與體會

梁華兵，盧興國

(1.浙江溫嶺市第二人民醫院檢驗科，浙江溫嶺317502;2.浙江大學醫學院附屬第二醫院血液科，浙江杭州310009)

胸腹水脫落腫瘤細胞學檢驗診斷，長期來是檢驗醫學中的弱項，其原因有三:其一為出版的相關專著絕大多數是用病理學方法和視角介紹的，不太適用于檢驗醫學的細胞形態學診斷;其二是檢驗醫學(包括院校)對胸腹水脫落細胞學檢驗診斷的基礎、技能教學(育)和培養的投入不足;其三是胸腹水腫瘤細胞學，即使同一病例標本，常表現千姿百態形態，評估性診斷時，又需要一定的臨床和病理為基礎，故普遍性重視不夠。臨床上，惡性胸腹水中，最常見的是癌細胞侵犯，包括兒童患者［1］，但對胸腹水標本送檢的要求、處理的方法、鏡檢的要求和形態學的把握等，文獻上報道的體會均有所不同［2～7］。現將我們13年來的一些實踐探索與體會作一介紹。

一、材料和方法

1.病例 1999年1月至2011年10月浙江溫嶺市第二人民醫院住院患者，經CT、B超和腫瘤標志物或病理組織學和(或)脫落細胞學等檢查而明確診斷的惡性腫瘤患者，臨床最后匯總各項檢查而確診的癌性胸腹水939例。其中男504例、女435例，年齡34～89歲;肺腺癌浸潤450例，肺鱗癌20例，肺小細胞性癌13例，胃癌171例，卵巢癌111例，胰腺癌85例，肝癌25例，乳腺癌18例，大腸癌16例，其他癌癥轉移30例;胸腹水細胞學檢查找到癌細胞409例，陽性率為43.6%。

2.標本處理 抽取的胸腹水由乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑塑料帶蓋標識專用試管抗凝(容積11 mL)，常規標本在0.5～1 h內280×g離心5 min，離心后傾去上清液，推片或涂片，Wright-Giemsa混合染色和細胞免疫化學染色(SP法)［4］，晾干后鏡檢。實驗標本放置時間和處理方法見結果。

3.觀察方法和形態學評判 觀察標本不同的處理方法、推片量與涂片法、標本放置時間、鏡檢方法和技巧以及掌握癌細胞形態對癌細胞檢出率的影響。回顧性觀察的陽性標本由2位專職學形態學檢驗醫師進一步確認。本實驗室規定的幾個細胞形態學定義或依據如下:細胞空泡形成是指胞質有1個或多個空泡出現者，細胞退化是指細胞比正常為大并出現胞膜溶解和(或)染色質結構模糊不清者;將細胞過大且胞核幼稚和畸形或胞質染色渾厚者，核仁大而藍染者和核形異常者，類似造血原始細胞而胞質偏位與囊泡和(或)小簇出現者，中大型細胞核背靠背或結對現象且胞質異常者，中大型細胞組成團狀、套疊現象和囊泡狀胞質結構者等，作為基本符合或提示癌細胞的依據;將其中胞質囊泡狀和(或)染色不均勻性、細胞嵌合狀和(或)套疊狀，以及上皮樣結構(如腺管狀和較規則狀細胞聚集一起)形態特征者，作為進一步評判基本符合或提示腺癌細胞的依據;將間皮細胞樣、大或巨大而散在性分布的癌細胞，常有多變形胞質和圈曲樣細胞團或角化珠樣結構者，作為進一步評判基本符合或提示鱗癌細胞的依據。

4.統計學方法 百分比數據，組間比較用SPSS12統計軟件包進行χ2檢驗。中位數組間比較用秩和檢驗。

二、結果

1.標本處理方法對癌細胞檢出率的影響(1)留取細胞沉渣方法:標本離心后去上清液有2種方法。習慣方法在離心后將試管內上清液倒掉，試管內殘留細胞液量平均達到100 μL甚至更多，制成的推片有核細胞往往不足。另一方法，是將經過離心的試管管底細胞沉渣端向里，一手持離心管緩慢棄去上清液，至80℃ ～90℃左右保持30 s，另一手持棉球吸去殘液。使沉渣殘留量濃縮至平均50 μL以下。我們在開展胸腹水癌細胞檢驗診斷的前7年，用前一方法處理臨床確診的411例癌性標本，152例找到癌細胞檢出率為37.0%;而后6年采用后一方法制備標本528例，257例找到癌細胞，檢出率48.7%，后組比前者提升較為明顯(χ2=12.85，P＜0.01);(2)推片標本量:對39例臨床診斷的癌性標本，分別制成3 μL和6 μL的普通推片和加厚推片，各3張。厚推片組17例(43.6%)找到癌細胞，而普通推片組找到癌細胞14例(35.9%，P＞0.05)，而癌細胞偶見(每張涂片＜3個癌細胞)者，厚片組和普通推片組分別為2例(11.8%)和5例(35.7%)，顯示加厚推片檢出癌細胞有若干優勢;(3)標本放置時間、溫度與細胞形態:隨機留取15例病例的非低蛋白血癥漏出液，其中炎癥性10例、癌性5例。留置每一患者胸腹水6例標本(6支專用試管)，分別在室溫下放置0.5、1、2、3、4 和 16 h，分次離心留取沉渣推片，觀察標本放置時間長短對細胞形態的影響。結果為0.5～2 h內處理的標本，細胞形態幾乎一樣;有1例標本至3 h時出現稍為明顯的核固縮和碎裂，至4h和16h明顯增多(表1)。空泡變性是胸腹水標本中最常見變化，在不同標本中空泡細胞懸殊(與標本性質有關);間皮細胞和癌細胞空泡放置3 h和4 h時的主要變化時空泡增大，甚至出現氣球樣大空泡(圖1)。癌細胞和間皮細胞退化均少，放置16h后才見退化細胞增加。淋巴細胞變化最不明顯，多數標本無異常形態，只2例見小空泡，退化細胞更少見，均不隨時間而發生明顯變化。在實驗觀察的13例中，至16h時仍有5例(38.5%)標本細胞形態與0.5h標本無異(P＞0.05)。

表1 不同放置時間胸腹水對細胞形態的影響(中位數，范圍%)

圖1 胸腹水放置后的細胞形態變化

另隨機留取6例非低蛋白血癥漏出液，每例一分為二。1例及時處理，另1例放置4℃冰箱12 h時處理。結果為放置4℃冰箱12 h標本與不放置4℃及時處理的標本，均未見出現明顯的形態差異，包括細胞空泡(中位數37%與40%)、退化(中位數4%與4%)、核固縮和碎裂(1%與1%)，組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

三、討論

我們在實踐中體會到，尋找胸腹水癌細胞最重要的是找到其。因此，要提高癌細胞檢出率，濃縮細胞量的處理方法即是其中的一個因素。可通過多次離心的方法提高細胞量［8］，但這需要較多的標本量和抗凝問題，并增加操作步驟。我們用11 mL專用試管容積量，離心后，在傾去上清液的方法上做了調整，即試管傾斜80℃ ～90℃ 30 s并用一顆棉球吸去過多的余液，達到了濃縮細胞量的一個重要步驟，可使沉淀的殘余液量比一般方法減少一半以上，同時又因細胞增加而容易制備滿意的推片。此外，增加每一推片的量又是其中的一個因素。相對而言，標本中細胞越多越容易檢出癌細胞，包括對檢出癌細胞數量和檢查費時的影響。我們將推片量由3 μL提高到6 μL，對個別癌細胞特別少的標本有明顯影響。所以我們規定體液脫落細胞學檢查制成的推片以厚片為佳，但必需有尾部。反復的實踐表明，5～6 μL的加厚推片尾部區域，細胞結構基本清晰。經離心濃縮的加厚推片有3個優點:聚集大細胞于局部，檢查費時少和易于找到并進一步評判癌細胞的上皮組織來源。推片的標本量中，還需考慮其中的紅細胞過多對癌細胞檢出的影響。紅細胞明顯增多時，常因離心后厚厚的紅細胞層而影響殘留細胞液量或所要求吸取白細胞層的細胞。此時，應將紅細胞去除，可往離心管內加入適量的低滲氯化鉀溶液(48 g/L氯化鉀溶液)，破壞紅細胞，再次離心后取沉淀物制片。也可用其他方法去除過多的紅細胞［2］。

在胸腹水細胞學檢驗中，人們普遍關注的是細胞退化造成對診斷的影響，故要求胸腹水標本盡可能新鮮，但在送檢的時間上尚缺乏一致的認識，可能也與缺乏一定的實驗有關。我們將標本放置不同時間后觀察表明，標本放置后，可觀察到細胞空泡、退化、核碎裂和固縮形態的增加或發生。但通過實驗發現放置2 h內處理的標本幾乎不對細胞形態產生影響(前后形態幾乎一致)，少數標本(1/13)在放置3h時出現核固縮和核碎裂增多，一部分標本(3/13)至4h出現細胞空泡增大和(或)增多。胸腹水標本真正的細胞退化只是一部分，較多的細胞形態改變都在標本獲得時就存在，因此，加強對不同病理狀態下的細胞形態識別十分重要。而且不同標本中的形態異常差異十分明顯，也有部分是由于推片機械性因素造成的類似退化性變化(細胞過度攤開)，后者與血片尾部細胞的部分形態變化一樣。在同一張標本中，當部分區域細胞退化而部分區域細胞結構清晰時，就可以評判為假性細胞退化。最容易發生空泡的是中性粒細胞和單核巨噬細胞，但他們通常對腫瘤細胞的形態鑒別不產生影響。最不易發生形態變化的是淋巴細胞，其很少出現空泡和退化，但淋巴細胞(尤其是腫瘤性)過多時則可在尾部出現涂抺細胞(推片所致機械性形變，個別標本很多)。最易發生退化的是間皮細胞和癌細胞，也是最易造成混淆者，而且放置后兩者的形態變化類似，這才需要加強區別的。我們認為對形態學的把握是最重要的，癌細胞胞體和胞核多不規則、細胞大多大而異形或成簇、核仁大多大而明顯、胞質多為豐富而染色不均，當癌細胞退化時仍會留有明顯的惡性形態特點，尤其是胞核的畸形和大核仁，而退化的間皮細胞形態幾乎與此相反，或顯示出明顯的不典型性改變，此外，還可結合細胞免疫化學染色作出鑒別。影響胸腹水標本細胞學改變的因素很多，除了人為影響外，有體液營養成分、體液滲透壓與病因(肝硬化和腎病所致的漏出性胸腹水細胞很容易發生細胞退化和機械性形變)、體液細胞量和實驗試管中標本量(標本量少易于形變)、溫度、試管的不同材質(玻璃的易于細胞變化)等，而普遍關注的放置時間因素僅是其中之一。我們認為臨床抽吸胸腹水后，用EDTA-K2抗凝劑塑料帶蓋標識專用試管抗凝的標本，在2 h內送到實驗室并及時處理，可以作為胸腹水細胞學送檢時間的規范要求。臨床上，會遇到夜間抽吸的胸腹水需要送檢。對此，我們還觀察了4℃保存標本對細胞形態的影響，發現實驗前、后無明顯的細胞學改變，認為對臨床來不及送檢的夜間標本(專用試管盛放)，置于4℃冰箱次日及時送檢和處理。

鏡檢標本區域對找到癌細胞的時間有影響，低倍和油鏡是鏡檢的兩個重要“武器”。鏡檢時先用低倍尋找可疑細胞而后轉到油鏡下確認，可以提高癌細胞的檢出效率。低倍巡視除了尾部區域外，對推片邊端和頭部區域，也同樣需要重視。推片的體部通常不予考慮，因此，部位厚而細胞結構不清，雖可檢出異常細胞但常不易評判，這也是部分病理細胞學診斷中用涂(抺)片法陽性率低的原因。此外，我們規定對細胞少見的標本和陰性標本，必須檢查所有染色的標本張數，至少3張;對臨床高度提示的病例，需要染色更多的標本并更仔細地用低倍尋找的鏡檢方法。細胞免疫化學染色有較好的參考價值，建議有條件的科室盡量同步開展，有助于細胞學作出進一步的評估［9］。

［1］Pradhan SB，Pradhan B，Dali S.Cytology of body fluids from different sites:an approach for early diagnosis of malignancy［J］.JNMA J Nepal Med Assoc，2006，45(164):353-356.

［2］支喜蘭.血性胸腹水脫落細胞學檢查涂片方法的比較［J］.診斷病理學雜志，2003，10(1):49-50.

［3］叢玉隆.實用檢驗醫學［J］.北京:人民衛生出版社，2009:304-315.

［4］羅玉琴，盧興國.胸腹水脫落細胞學檢驗質量管理的初步體會［J］.臨床檢驗雜志，2005，23(5):396-397.

［5］范賢斌，徐 志，邵 鳳.胸腹水細胞學檢查在良惡性積液中的應用及體會［J］.中國鄉村醫學，2005，12(1):51-52.

［6］許成英.提高胸腹水細胞學檢查陽性率方法探討［J］.浙江腫瘤，2000，24(1):62-63.

［7］曹 敏，魏紅權，陳培輝.477例擬診癌癥患者胸腹水細胞學診斷探討［J］.實用腫瘤雜志，2003，18(4):304-305.

［8］趙中華，劉 艷，林 云，等.二步離心法在漿膜腔積液常規細胞形態學檢查中的應用［J］.江西醫學檢驗，2007，25(1):70.

［9］黃衛彤，覃志堅，潘興壽，等.胸腹水細胞學與組織學制片的免疫細胞化學診斷對比研究［J］.江西醫學檢驗，2006，24(1):17-18.