HR-HPV DNA PCR聯合TCT檢測對宮頸癌前病變的診斷價值

陳炎添，陳青龍，熊 燕，蘇雪棠，黃偉剛，石 勝，郭翼華，陳榮策

(江門市人民醫院檢驗科，廣東江門529020)

宮頸癌作為婦科生殖道三大惡性腫瘤之一，嚴重影響女性身心健康及生命安全。我國宮頸癌的發病率及病死率比較高，年發病率超過全世界發病率的30%，每年大約死于宮頸癌的患者約有5萬人［1］。有文獻報道，早期宮頸癌患者的5年治愈率可高達90%，所以早發現、早診斷、早治療對于宮頸上皮內瘤變的患者有重大的意義［2］。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續感染是癌前病變及宮頸癌發病的重要致病因子［3］，有學者將高危型(higu risk，HR)-HPV DNA檢測作為宮頸癌篩查方法之一［4］。本研究擬探討宮頸液基薄層細胞學檢查(thinprep cytology test，TCT)聯合 HRHPV DNA聚合酶鏈反應(PCR)檢測在提高宮頸癌前病變的早期診斷中的價值。

材料和方法

一、研究對象

收集2009年10月至2011年9月來江門市人民醫院婦產科門診進行宮頸癌前病變篩查的女性948例，年齡20～65歲，平均年齡41.8歲，所有病例均無子宮頸錐切、急性生殖道炎癥及子宮切除等病史。

二、儀器、試劑及試驗方法

1.HPV DNA PCR 采用廣州中山大學達安基因股份公司生產的核酸擴增儀DA-7600型檢測系統進行PCR擴增、雜交、洗膜及顯色，使用原裝配套試劑HR-HPV(18個型)核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光法)，可同時檢測18種HR-HPV亞型，包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4。用宮頸刷置于宮頸口轉動4圈，以取得足量的分泌物及脫落細胞，然后將宮頸刷放入備有1 mL洗脫液的專用洗脫管中送檢或保存于-20℃冰箱待測。檢測時將宮頸刷在洗脫管中充分漂洗，把洗脫液全部轉移到1.5 mL微量離心管中，11 600×g離心10 mim，棄去上清液，保留管底的細胞塊。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，100℃水浴加熱10 min，11 600×g離心10 min，保留上清液待用。HPV基因擴增:取1 μL DNA抽提液，加入HPV PCR擴增體系，按照試劑盒的擴增程序進行擴增反應。導流雜交法進行HPV基因的分型:將20 μL生物素標記的PCR產物經過變性，與1 mL預熱至45℃的雜交緩沖液混合，在導流雜交儀HybriMax上45℃孵育5 min后進行導流雜交。雜交后再用0.8 mL雜交緩沖液沖洗3次。在25℃下用封阻液封阻孵育5 min。封阻后加入0.5 mL酶標液孵育3.5 min。用沖洗緩沖液A沖洗雜交膜，去除未結合的酶標液，顯色過程中加入0.5 mL四唑硝基藍(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)底物在36℃保持3～5 min或直到顯色完成為止。在顯色后1 h內察看分析結果。

2.TCT 擦去宮頸表面黏液，將宮頸細胞刷插入距宮頸管內1 cm處，順時針旋轉5圈左右，取出轉入細胞保存液中，對于瓶中收集到的細胞經Prep 2000系統程序化進行薄片涂片染色，TCT制片后，均由專門醫師閱片報告。診斷標準采用2001年國際癌癥協會TBS診斷系統:(1)正常范圍;(2)意義不明的非典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)和腺細胞(AGUS);(3)不除外高度鱗狀上皮病變不典型鱗狀細胞(ASC-H);(4)低度鱗狀上皮內病變(LSIL);(5)高度鱗狀上皮內病變(HSIL);(6)鱗狀細胞癌(SCC)和腺癌。

3.病理學檢查 對于TCT以及HR-HPV DNA PCR結果呈陽性的病例均通過電子陰道鏡下或宮頸錐切下行病理活檢，組織病理學CIN分級按Riehart標準判定診斷結果。

三、統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件進行統計處理，本研究數據為成對計數數據，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

一、TCT陽性合并HPV陽性者共259例，其中的 AUSCS、LSIL、HSIL、SCC 4 種類型的陽性例數及HPV感染率，見表1。各組間的HPV感染率、HR-HPV感染率、低危型(LR)-HPV感染率互相比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)，即隨著癌前病變級別的升高，HR-HPV的感染率亦明顯升高。說明ASCUS和LSIL患者多為HPV陰性或LR-HPV感染的患者，HSIL和SCC患者多為HR-HPV感染的患者，同時提示SCC與HR-HPV感染密切相關。

二、TCT結果異常者540例，其中活檢為異常者144例，符合率為26.7%;TCT正常者408例，其中活檢為正常者408例，符合率為100.0%，兩者差異具有統計學意義(P＜0.01)。

三、活檢確診 CINⅡ級以上者73例，HRHPV陽性66例，敏感性90.4%，TCT陽性60例，敏感性為82.2%，兩者敏感性差異無統計學意義(P＞0.05)。2種方法聯合檢測敏感性升高，與TCT和HR-HPV單獨檢測敏感性比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。活檢確診為陰性者804例，HR-HPV檢測陰性。HR-HPV、TCT及HR-HPV和TCT聯合檢測的陽性預測值分別為25.5%、11.1%、28.2%，陰性預測值分別為 68.8%、 59.2%、40.8%，見表2。

表1 ASCUS、LSIL、HSIL、SCC 4種類型的陽性例數及HPV感染率的比較

表2 宮頸癌HR-HPV和TCT的敏感性、特異性 (%)

討 論

由于從宮頸癌前病變發展為宮頸癌是一個時間漫長的過程，如果能及時早期發現宮頸癌并給予恰當的處理，宮頸癌是可以治愈的。女性在感染HPV后，30% ～50%會出現宮頸上皮內輕度病變，但大部分在感染HPV后轉為正常，只有HRHPV持續感染的女性，才成為宮頸癌的高發人群［5］。由HR-HPV感染到發展成為宮頸癌約需9～25年時間，潛伏期長有可能與病毒整合到宿主核基因組適當的位置需要很長時間有關［6］，因此，選擇合理、規范的宮頸癌早期篩查的方法對于提高其檢出率具有重要意義［7］。目前使用TCT方法能夠采集到頸管細胞，制作時剔除了宮頸黏液和炎性細胞，其清晰度和檢出率均明顯高于常規的宮頸涂片，但同時也發現TCT對HPV診斷有一定的漏診率［8］。從本研究結果可以看出，聯合檢測TCT和HR-HPV對宮頸癌的檢出率比單獨檢測TCT或HR-HPV高，聯合檢測方法對診斷宮頸癌具有重要意義。

本研究中TCT陽性的患者，HR-HPV感染率隨著宮頸病變程度的加重呈上升趨勢，從而認為HR-HPV感染與宮頸病變的嚴重程度呈正相關。宮頸癌的篩查中HR-HPV檢測是一個非常有意義的指標。本研究還發現，ASCUS與LSIL患者多為HPV陰性或LR-HPV感染的患者，HSIL與SCC患者多為HR-HPV感染的患者，從而說明感染HPV的危險類型與細胞學分級一致，低危型者細胞分化好，高危型者細胞分化差，與文獻［9］報道相類似。

［1］紀麗偉，童婷婷，虞 晴.TCT及陰道鏡下活檢在宮頸疾病中的診斷價值［J］.中國實驗診斷學，2010，14(5):735-737.

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