不育患者精液的氧化應激對精子DNA完整性等參數的影響

焦瑞寶，馮恒孝，唐吉斌，方軍，鳳俊蓉，詹三華，周萍，陳然

(1.銅陵市人民醫院臨檢中心，安徽銅陵244009;2.銅陵市人民醫院中醫男科，安徽銅陵244009;3.銅陵市人民醫院泌尿外科，安徽銅陵244009;4.銅陵市人民醫院不孕癥科，安徽銅陵244009;5.銅陵市人民醫院藥劑科，安徽銅陵244009)

世界衛生組織統計顯示，發達國家約有5% ～8%的夫婦受到不孕癥的影響，有的非洲國家不孕癥的患病率可高達30%，我國約為1% ～5%。不孕不育發病率有逐年上升的趨勢，男方因素約為一半。而引起男性不育癥的原因很多，比如精神壓力、吸煙酗酒、環境污染、生活方式改變等。近年來國內、外研究證實［1-2］，精液的氧化應激(oxidative stress，OS)是造成男性不育的重要原因之一。

在生殖系統中，少量持續的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是精子受精、獲能等生理過程所必需的，起了重要作用。精液中活性氧的來源有兩種:(1)人類精液中多形核白細胞(WBC)具有很強的ROS生成能力;(2)精子自身，精子線粒體呼吸鏈上的一系列氧化反應產生的，在正常情況下通過自氧化一種或多種還原物質釋放少量的活性氧;另外一種途徑是存在精子膜上的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶與其底物反應生成ROS［1］。當生殖道出現感染等情況時，作為第一道防御機制的中性粒細胞∕巨噬細胞吞噬病原微生物，代謝旺盛，產生過多的ROS。附睪是精子成熟和儲存的部位，也是生殖道中保護精子對抗氧化損傷的重要部位，多種抗氧化物和抗氧化酶的mRNA分布于附睪中［1］。本研究旨在全面分析男性不育精液的氧化應激反應對精子動態參數、形態參數、功能參數精子DNA完整性等的影響，探討其作用機制。

材料和方法

一、研究對象

選擇2011年9月至2011年12月在銅陵市人民醫院中醫男科、泌尿科以及不孕癥門診就診的92例男性不育患者，排除無精子癥、精液量過少(＜0.5 mL)、精液部分丟失者以及資料不全的患者11例，余下81例作為研究對象(排除女方因素)，患者年齡20～35歲，身體健康，無睪丸外傷、家族遺傳性疾病史及性功能障礙病史，無不良生活習慣(如煙酒等嗜好)，體檢睪丸、附睪及輸精管無明顯異常。21名健康對照組來源于本院年輕職工，年齡25～30歲，妻子剛懷孕滿12周至孩子出生未滿1周歲的男性醫務人員作為健康對照組。

二、儀器及試劑

1.計算機輔助精子動態、形態分析系統由南京大學捷達軟件工程有限公司提供;721可見分光光度計由上海元析儀器有限公司提供;BX41型熒光顯微鏡為OLYMPUS公司產品;KDC-40低速離心機由安徽中科中佳科學儀器有限公司生產。

2.微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒、總抗氧化能力試劑盒由江蘇南京建成生物工程研究所生產提供;精子核吖啶橙(AO)染色試劑盒、精子膜檢測(低滲腫脹法)試劑盒、精液WBC過氧化酶染色(正甲苯胺法)試劑盒、精子形態(Diff-Quik)快速染色試劑盒均由深圳華康生物醫學工程有限公司生產提供。

三、實驗方法

1.精液標本采集 所有研究對象按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(以下簡稱5版)［3］要求在取精前禁欲3至5 d，至少禁欲48 h，手淫法采集精液于干燥無菌取精杯中，要求在實驗室附近取精室留取，或者在家里留取要求保溫(25～30℃)，在1 h內送至實驗室。

2.精液動態分析 按5版要求嚴格操作，將送來的精液標本置37℃水浴箱中，觀察液化狀態，取充分混勻的精液5 μL置于計算機輔助精子動態分析系統上進行精子質量參數分析，并記錄檢測結果。

3.精子形態學分析、精子膜低滲膨脹試驗、精液WBC過氧化酶正甲苯胺染色試驗 按5版推薦Diff-Quik快速染色法和 Kruger等［3］標準，在計算機輔助精子形態分析系統上分析200個精子形態。在MACRO精子計數盤中，計算200個精子中腫脹精子的百分率。涂片在高倍鏡下觀察，其中，棕色細胞為過氧化酶陽性細胞，而過氧化酶陰性細胞不著色，用精子專用計數板計數棕色細胞濃度。

4.精液微量MDA測定 精子膜脂類過氧化反應的程度以反應產物MDA的產量表示，MDA測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。取待測精液0.1 mL為測定管，并設測定空白管，以及標準管及標準空白管，嚴格按照說明書操作，分別加入試劑。直接測得原始MDA后需要修正，修正MDA是將精子濃度高于20×106/mL的患者調整為20×106/mL，目的是為了排除由于過多精子自身產生MDA的影響，通過換算得到后的濃度［4］。修正MDA的計算公式=原始MDA÷(精子濃度/20×106/mL)。

5.精液總抗氧化能力(TAC)測定 精液中有許多抗氧化物質，包括酶促與非酶促體系，均能使Fe3+還原成Fe2+，而與Fe2+菲啉類物質形成穩定的絡合物，反應設定空白對照管，通過比色可測定出其抗氧化能力的高低。其中，1個總抗氧化能力單位定義是在37℃，每分鐘每毫升血清(漿)使反應體系的吸光度(A)值每增加0.01時，為1個總抗氧化能力單位。具體實驗操作參見試劑盒使用說明書。氧化應激指數(OSI)是評價男性不育患者精液內活性氧與抗氧化之間的動態平衡的，是在權衡活性氧指標對精子膜傷害以及精液自身抗氧化系統的狀態指數［5］，計算公式OSI=修正后MDA/TAC×100%。

6.精子DNA完整性的檢測 精液液化并計數，取液化精液1.0 mL加于離心管內，1 000×g離心5 min，去除精漿，加1 mL稀釋洗滌液，充分混勻。500×g離心5min，去上清液，如此共洗滌3次;最后1次洗滌完畢，棄上清液，用稀釋洗滌液調整精子濃度為20×106/mL。取5～10 μL懸浮液于清潔載玻片上涂片，晾干，滴加數滴乙醛固定液固定10 min，后將玻片直立于吸水紙上以除去固定液;滴加數滴新鮮配制的吖啶橙工作液染色5 min，流水沖洗，晾干;熒光顯微鏡(OLYMPUS—BX41)觀察(激發濾光片波長460～490 nm)，每個視野觀察時間不超過40 s。利用AO異染性，AO與雙鏈DNA結合發出綠色熒光，與單鏈DNA結合發出紅色或黃色熒光，計數200個精子中綠色、紅色和橙黃色精子數。計算出紅色、橙黃色熒光精子的百分率，即為精子DNA碎片化指數(DNA fragmentation index，DFI)，精子 DNA 完整性 =1-DFI。

四、統計學方法

結 果

將81例男性不育患者的活性氧指標MDA按原始檢測結果劃分:＜5 nmol/mL為30例，5～＜10 nmol/mL為21例，10～＜15 nmol/mL為16例，15～＜20 nmol/mL為5例，≥20 nmol/mL為9例;TAC按檢測結果劃分:＜10 U/L為3例，10～＜15 U/L為13例，15～ ＜20 U/L為16例，20～＜30 U/L為23例，≥30 U/L為26例。

將81例男性不育患者按精液分析的結果分為:少精癥組(精子濃度＜15×106/mL)共5例;活力Ⅰ組為弱精子癥組［即精子前向運動(PR)＜32%］共31例;活力Ⅱ組為前向運動精子32% ＜PR＜50%組共25例;活力Ⅲ組為前向運動PR＞50%組共11例;WBC精子癥組(簡稱為白精癥組，即精液WBC計數＞1×106/mL)共9例;另設健康對照組21名。各不育組與對照組的參數比較見表1。

表1 81例男性不育患者和21名健康對照組精液參數的比較

各病例組修正后MDA與健康對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或0.01);隨著精子活力下降，精子MDA呈增加趨勢;且活力Ⅰ組、活力Ⅱ組、活力Ⅲ組MDA濃度分別與少精癥組、白精癥組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。各組TAC值，與健康對照組TAC比較差異有統計學意義(P＜0.01);活力Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組3組之間比較，差異無統計學意義;少精癥組、白精癥組與其他3組病例組比較，差異無統計學意義，但呈下降趨勢。

OSI與各精液參數的相關性分析見表2。

表2 OSI與精子分析參數的相關性分析

討 論

1979年 Jones等［6］首次提出，人類精子對氧化應激特別敏感，氧化應激可能是造成男性不育的一個重要原因。人類精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸，并具有多個雙鍵，這些雙鍵是維持精子膜流動性所必需的，脂質對受精過程中精卵識別和膜的融合、精子與頂體的融合及精子膜上去能物質的清除都有十分重要作用。由于高濃度不飽和脂肪酸極易受自由基的攻擊，這對精子本身又構成了一種潛在的危險。在氧自由基的攻擊下，精子膜的不飽和脂肪酸發生脂類過氧化反應，使脂肪酸失去雙鍵，進而使精子膜失去流動性，最終導致精子功能障礙和男性不育。MDA是不飽和脂肪酸代謝終產物之一，其生成量可反映精子膜的脂類過氧化程度。

在精子發生過程中，各級生精細胞核內與DNA結合的蛋白隨著DNA含量的規律變化而變化，經歷組蛋白到過渡蛋白再到魚精蛋白的組型轉換。成熟的精子，其DNA與精核蛋白(主要是魚精蛋白)之間存在著獨特結合方式，DNA鏈緊密纏繞魚精蛋白分子，形成緊密且高度有序的環，使精子染色質高度緊密完整，從而能保護精子基因免受外部應激狀態損傷。精子染色質結構分析法(SCSA)原理是受損DNA在酸作用下變性為單鏈，利用AO異染性，AO與雙鏈DNA結合發出綠色熒光，與單鏈DNA結合發出紅色或黃色熒光。AO熒光染色后，核完整性評估在熒光顯微鏡和流式細胞儀下均能完成，兩者原理一致。但與熒光顯微鏡相比，在流式細胞儀下觀察染色后精子DNA變化更加詳細準確，易標準化，且具有較高可復性、明確的臨床應用價值，被認為是精子染色質完整性檢測的“金標準”［7］。

活性氧、氧化應激與男性不育癥之間的關系，近來得到男科以及生殖醫學界廣泛關注。本項目研究為了避免精液離心和冷凍復蘇對精液活性氧指標 MDA 影響，借鑒國外專家建議［1，5］采用新鮮精液測定原始MDA含量，同時采用將原始精子濃度＞20×106/mL換算為20×106/mL得出換算系數，計算排除精子濃度過高由精子自身產生的活性氧帶來影響，得到修正后MDA水平。修正后MDA含量隨著精子活力的下降，精子MDA呈現增加的趨勢;而且活力Ⅰ組，活力Ⅱ組，活力Ⅲ組的MDA濃度分別與少精癥組、白精癥組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01);說明精液內過多活性氧存在導致精子膜發生脂質過氧化反應產生MDA，破壞精子膜結構的完整性，引起精子運動能力下降，引起精子正常形態率降低。而TAC測定采用精漿，不受精子濃度的影響，相對比較穩定。

近年來，國外多位專家［1，5］倡導新指標—OSI評價精液氧化應激水平，應用精子活性氧與TAC比值來換算得到，該指數兼顧活性氧含量、TAC之間變化因素。研究顯示，精液OSI與精子濃度及總數、MDA含量以及核DNA碎片化指數(DFI)成正相關，且差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);OSI與精子活率、PR、VAP、VSL、HOS、快速直線運動精子濃度及總數、TAC以及正常形態率呈負相關，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與毛毳等［8］開展的體外人工試驗有相似之處。生殖系統如急慢性炎癥、細菌、支原體和衣原體等感染，多種疾病、不良生活習慣等均可引起局部氧自由基增加導致精液的氧化應激反應，氧化應激會導致精子膜完整性降低，精子運動能力下降，正常形態率下降［9］。精子DNA核酸含有親核基團，活性氧自由基能與其堿基反應使DNA鏈聚集，改變DNA正常結構，造成DNA鏈斷裂，也通過脂質過氧化作用影響DNA，引起超氧化物歧化酶(SOD)基因表達變化，使合成減少，核DNA碎片化指數上升［10］。

氧化應激反應是近來受到較多關注男性不育病因之一，由于各種因素引起活性氧產生過多，TAC的下降，精液發生氧化應激反應，可造成精子動態參數、形態參數，以及功能參數的改變。這些改變可能是氧化應激反應引起男性不育的重要機制之一。

［1］Hammadeh ME，Al Hasani S，Rosenbaum P，et al.Reactive oxygen species， total antioxidant concentration of seminal plasma and their effect on sperm parameters and outcome of IVF/IC SI patients［J］.Arch Gynecol Obstet，2008，277(6):515-526.

［2］Tunc O，Thompson J，Tremellen K.Development of the NBT assay as a marker of sperm oxidative stress［J］.Int J Androl，2010，33(1):13-21.

［3］世界衛生組織.人類精液檢查與處理實驗室手冊［M］.第5版.北京:人民衛生出版社，2011:53-86.

［4］陳俊清，羅勝萍，黃誠剛.精漿活性氧水平與男性不育的相關性研究［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32(9):1002-1004.

［5］Agarwal A，Makker K，Sharma R.Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility:an update［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59(1):2-11.

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［7］陳建偉，張曉霞，崔 云.雙尾彗星實驗檢測精子DNA完整性的方法學建立［J］.檢驗醫學，2012，27(1):21-25.

［8］毛 毳，張 丹，王成芳，等.氧化應激性損傷對不育男性精子功能的影響［J］.四川大學學報(醫學版)，2010，41(4):723-724.

［9］何 江，余伍忠，鄒紅云，等.吸煙對男性不育患者精子活力和動態參數的影響及相關性研究［J］.檢驗醫學，2011，26(4):217-221.

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