銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

馬駿，季亢挺，官學(xué)強(qiáng)，李繼武，唐疾飛

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類(lèi)機(jī)體出生后存在的干/祖細(xì)胞，能特異性歸巢于血管損傷及新生部位，并分化成內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生和再內(nèi)皮化[1]。氧化低密度脂蛋白（oxidative low-density lipoproteins，Ox-LDL）造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷是高膽固醇血癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。目前研究[3-5]表明高膽固醇血癥不僅造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同樣影響EPCs的數(shù)量和功能。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究[6-7]多集中于銀杏內(nèi)酯B對(duì)損傷的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制的探討，罕見(jiàn)關(guān)于銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs的保護(hù)機(jī)制的報(bào)道。本研究采用Ox-LDL誘導(dǎo)損傷人外周血EPCs，建立EPCs氧化損傷模型，觀察不同濃度的銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床藥物使用的有效性及藥物使用濃度提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 纖維連接蛋白購(gòu)于Chemicon公司，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）購(gòu)于PeproTech公司，胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）及銀杏內(nèi)酯B（純度大于90%，HPLC）購(gòu)于Sigma公司，胰酶及M199培養(yǎng)液購(gòu)于GIBCO公司，CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（WST法）、丙二醛（MDA）試劑盒（TBA法）及細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，Ox-LDL購(gòu)于上海麥莎生物科技有限公司，VIII因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心提供SGC-7901胃癌細(xì)胞株，F(xiàn)ITC-VECadherin購(gòu)于Bender system公司，PE-CD34購(gòu)于CALTAG LABORATORIES公司，PE-KDR（VEGFR-2）及FITC-CD133購(gòu)于R＆D Systems公司， 細(xì)胞培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶購(gòu)于Corning公司，流式細(xì)胞分析儀購(gòu)于BD公司，680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司。

所有外周血均采自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行心內(nèi)電生理檢查的住院患者，并經(jīng)患者授權(quán)同意。1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離外周血，收集到的懸浮細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板（纖維連接蛋白預(yù)包被），每孔加入1 mL M199培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL bFGF、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素），將培養(yǎng)板置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，每3 d去除未貼壁細(xì)胞及碎片，更換一半培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 人外周血EPCs鑒定：予胰酶消化下培養(yǎng)6 d的貼壁細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞VEGFR-2、VECadherin、AC133及CD34的表達(dá)。用免疫組化法測(cè)定貼壁細(xì)胞VIII因子相關(guān)抗原，胃癌細(xì)胞株作為陰性對(duì)照。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將銀杏內(nèi)酯B粉劑溶解于DMSO分裝，儲(chǔ)存濃度為100 mg/mL。其中DMSO終濃度≤0.1%，此濃度對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)毒性。在培養(yǎng)至第6天，換用不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將各孔細(xì)胞消化下來(lái)制成細(xì)胞懸液，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)。隨機(jī)分為4組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。

正常對(duì)照組：細(xì)胞在含0.1% DMSO的無(wú)血清M199培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)24 h。

銀杏內(nèi)酯B 0.05 mg/mL組：細(xì)胞用含0.05 mg/mL銀杏內(nèi)酯B+0.05% DMSO的無(wú)血清M199培養(yǎng)液預(yù)處理6 h后，棄原液；用含0.05 mg/mL銀杏內(nèi)酯B+0.05% DMSO+0.05 mg/mL Ox-LDL的無(wú)血清M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18 h。其DMSO的終濃度為0.1%。

銀杏內(nèi)酯B 0.1 mg/mL組：細(xì)胞用含0.1 mg/mL銀杏內(nèi)酯B的無(wú)血清M199培養(yǎng)液預(yù)處理6 h后，棄原液；用含0.1 mg/mL銀杏內(nèi)酯B+0.05 mg/mL Ox-LDL的無(wú)血清M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18 h。其DMSO的終濃度為0.1%。

Ox-LDL損傷組：細(xì)胞用含0.1% DMSO的無(wú)血清M199培養(yǎng)液預(yù)處理6 h后，棄原液；用含0.05 mg/mL Ox-LDL+0.1% DMSO的無(wú)血清M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

按照上述步驟干預(yù)后，進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)。

1.2.4 外周血EPCs活力的檢測(cè)：收集貼壁細(xì)胞并接種到培養(yǎng)板，按1.2.3方法分組干預(yù)，并用含0.1%DMSO的無(wú)血清M199培養(yǎng)液設(shè)空白孔。干預(yù)后加入CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)后測(cè)定450 nm吸光度，參比波長(zhǎng)為630 nm。根據(jù)所測(cè)OD值計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.2.5 細(xì)胞裂解液SOD活力及MDA含量檢測(cè)：貼壁細(xì)胞按1.2.3方法分組干預(yù)，取得細(xì)胞裂解液；分別依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，配制測(cè)定孔及各種空白對(duì)照孔；將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀，測(cè)定450 nm吸光度，根據(jù)所測(cè)OD值計(jì)算SOD活力；測(cè)定540 nm吸光度，據(jù)所測(cè)OD值計(jì)算MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包。所有結(jié)果以 ±s表示，采用單因素方差分析比較各組均數(shù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的表型及鑒定 培養(yǎng)7 d左右絕大多數(shù)細(xì)胞分化為梭形細(xì)胞，中央的圓形細(xì)胞逐漸脫落。培養(yǎng)2周后，細(xì)胞可見(jiàn)鋪路石樣排列，自發(fā)排列成索條狀或管腔狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞不再增殖，消化后能重新貼壁。人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)6 d后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表達(dá)VEGFR-2、VE-Cadherin、AC133及CD34。其中VEGFR-2陽(yáng)性細(xì)胞比例為（30.46±9.23）%，VE-Cadherin陽(yáng)性細(xì)胞比例為（44.69±9.74）%，AC133陽(yáng)性細(xì)胞比例為（19.68±0.81）%，CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例為（65.09±11.89）%。培養(yǎng)2周后細(xì)胞VIII因子相關(guān)抗原免疫組化陽(yáng)性，胞漿呈棕黃色，一抗以PBS替代的空白對(duì)照不顯色，作為對(duì)照的胃癌細(xì)胞也不顯色。

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷后EPCs活力、SOD活力及MDA水平的影響 見(jiàn)表1。共同孵育人外周血EPCs與Ox-LDL 18 h后，其細(xì)胞增殖能力明顯受抑制，其加入CCK8試劑后在450 nm的OD值明顯低于正常對(duì)照組。而經(jīng)過(guò)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理后EPCs的OD值較Ox-LDL損傷組升高，且與銀杏內(nèi)酯B呈濃度依賴(lài)（見(jiàn)圖1）。各組OD值結(jié)果提示銀杏內(nèi)酯B呈濃度依賴(lài)性升高Ox-LDL損傷后EPCs的細(xì)胞生存率（見(jiàn)圖2）。

表1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷EPCs增殖能力、細(xì)胞生存率、SOD活力及MDA含量的影響（ ±s）

圖1 CCK8試劑盒測(cè)定各組EPCs的增殖能力

圖2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)細(xì)胞生存率的影響

Ox-LDL誘導(dǎo)損傷后EPCs細(xì)胞裂解液的SOD活力較正常對(duì)照組明顯下降。經(jīng)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理后，EPCs與Ox-LDL共同孵育18 h的SOD活力雖不及正常對(duì)照組，但較Ox-LDL損傷組有明顯增高，且銀杏內(nèi)酯B增高SOD活力的效應(yīng)呈明顯的濃度依賴(lài)性（見(jiàn)圖 3）。

圖3 各組SOD水平

Ox-LDL誘導(dǎo)損傷后EPCs細(xì)胞裂解液的MDA水平較正常對(duì)照組明顯升高。而經(jīng)不同濃度銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理后MDA的水平雖然明顯降低，但較正常對(duì)照組仍有明顯差異，且不同濃度銀杏內(nèi)酯B降低MDA的水平亦有差異（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組MDA水平

3 討論

動(dòng)脈內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，當(dāng)EPCs數(shù)量減少及功能缺陷時(shí)，損傷的內(nèi)皮得不到快速而完整的修復(fù)，由于缺乏負(fù)反饋，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，大量的炎癥因子導(dǎo)致內(nèi)皮進(jìn)一步損傷，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。Ox-LDL增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；也可抑制SOD和過(guò)氧化物酶的活性，增加細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的死亡和凋亡[10-11]，使動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙和損傷。Ox-LDL通過(guò)直接損傷EPCs、增加EPCs的凋亡、影響EPCs的分化和動(dòng)員，導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少和功能減弱。其中氧化應(yīng)激損傷在Ox-LDL直接損傷EPCs過(guò)程中可能起重要作用[12]。

銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物中主要的活性成分之一，其作為強(qiáng)大的血小板活化因子（PAF）拮抗劑，已得到許多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，在改善腦缺血-再灌注、抗休克、急性胰腺炎的救治、保護(hù)心肌等眾多治療領(lǐng)域發(fā)揮作用。Zhou等[13]、Kitamoto等[14]證實(shí)銀杏內(nèi)酯B具有抗感染、清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。銀杏內(nèi)酯B對(duì)離體大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[6]、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注的保護(hù)作用[7]，均認(rèn)為與其清除脂質(zhì)過(guò)氧化物、保持抗氧化酶活性相關(guān)。但銀杏內(nèi)酯B對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用和機(jī)制了解較少。對(duì)EPCs的保護(hù)作用更是鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究率先通過(guò)觀察銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs氧化損傷模型的影響，以驗(yàn)證其保護(hù)作用，探討其可能的機(jī)制。

本研究采用CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒來(lái)衡量細(xì)胞的存活情況。結(jié)果表明經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)后EPCs活力下降、細(xì)胞凋亡增加、生存率降低。而經(jīng)不同濃度銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理后，其EPCs的存活率雖仍較正常低，但較Ox-LDL損傷組明顯升高，提示銀杏內(nèi)酯B可抑制細(xì)胞損傷及凋亡，且其效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性。進(jìn)一步檢測(cè)各組SOD活力，可見(jiàn)經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)后各組SOD的活力明顯較對(duì)照組下降。而銀杏內(nèi)酯B保護(hù)組SOD活力則較損傷組顯著升高。同時(shí)銀杏內(nèi)酯B呈濃度依賴(lài)性地降低由Ox-LDL誘導(dǎo)升高的MDA含量。

SOD在細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激中至關(guān)重要，被稱(chēng)為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。SOD活力的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并形成分解代謝產(chǎn)物MDA。MDA具有細(xì)胞毒性，其高低間接反映了氧自由基的濃度。MDA目前是常用的膜脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，能夠較好地反映細(xì)胞氧化損傷的程度。脂質(zhì)過(guò)氧化損傷在冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病中日益受到重視[15]。

由此可見(jiàn)，本研究表明銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)有重要影響。銀杏內(nèi)酯B可能通過(guò)提高EPCs的抗氧化酶活性及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，從而對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。

既往銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的研究與本研究結(jié)果不盡相同。林宇等[16]研究證明銀杏內(nèi)酯B能夠抑制TNFα誘導(dǎo)的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS的水平，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，此作用可能是通過(guò)抑制ROS介導(dǎo)的ERK2激酶及轉(zhuǎn)錄因子AP-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。Li等[17]利用Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型研究銀杏內(nèi)酯B抗氧化作用，認(rèn)為銀杏內(nèi)酯B小劑量時(shí)就具有直接抗氧化作用，但在細(xì)胞水平抑制ROS的產(chǎn)生需要大劑量；機(jī)制可能是銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用并非通過(guò)直接抑制MDA的生成，而是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子的上游蛋白質(zhì)分子—絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，進(jìn)而阻斷下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。于曉紅等[18]利用銀杏內(nèi)酯B抑制TNFα誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，其作用可能是通過(guò)抑制NADPH氧化酶途徑的ROS產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的。目前對(duì)銀杏內(nèi)酯B的血管內(nèi)皮保護(hù)研究剛剛起步，同時(shí)國(guó)內(nèi)提純以及合成銀杏內(nèi)酯的工藝造價(jià)高，限制了銀杏內(nèi)酯的廣泛研究，其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制了解甚少。而本研究探討的銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs的氧化損傷保護(hù)作用，其保護(hù)作用是否同血管內(nèi)皮細(xì)胞完全相似，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究從氧化損傷角度證實(shí)了銀杏內(nèi)酯B對(duì)EPCs的保護(hù)作用，而血管內(nèi)皮損傷有多種機(jī)制參與。銀杏內(nèi)酯B是否也通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制NF-κB信號(hào)通路等其他機(jī)制發(fā)揮保護(hù)EPCs的作用，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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