大腸癌原代細胞培養方法的探索

袁航，屠世良

（浙江省人民醫院 肛腸外科，浙江 杭州 310014）

由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用于腫瘤發生機制、抗腫瘤藥物檢測、癌分子生物學等研究。較之目前國內大腸癌細胞研究多采用細胞株的方式，原代培養更符合體內生理狀態，其實驗數據更具有說服力。但原代培養因成功率低，時間、試劑、人力成本高等原因，未能被廣泛應用。本研究通過綜合國內外大腸癌細胞原代培養方法的報道，對各種培養方法加以改進利用，尋求更優化更高效的原代培養方法，以期為大腸癌基礎研究做準備工作。

1 材料和方法

1.1 實驗標本 標本來自手術切除的未經放射治療和抗腫瘤化學藥物治療的新鮮無菌人大腸癌組織。大腸癌診斷以腫瘤組織的病理學檢查為依據。取材按腫瘤大體類型、腫瘤分化程度、取材位置分類。

按腫瘤大體類型：①腫塊增生型：主要向腸腔內生長，呈球狀或半球狀；②潰瘍浸潤型：中央部壞死，形成大潰瘍，邊緣外翻呈蝶形，或癌組織沿腸壁浸潤生長，有明顯纖維組織反應。

按腫瘤分化程度：癌細胞排列呈腺管狀或腺泡狀，按Broder法分為高分化（I級）、中分化（II級）、低分化（III級）和未分化（IV級）癌。取材時按照I～II級、III～IV級進行分類。

按取材位置：①腫瘤中央；②腫瘤周邊。按以上分類標準配對，即有8個取材方案。

1.2 試劑及儀器 RPMI 1640培養液（含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10μg/mL胰島素、生長激素100μg/L）、DMEM細胞培養基、Hanks洗液（含1000 U/mL青霉素、1000 U/mL鏈霉素、3μg/mL兩性霉素）、胎牛血清、眼科剪、眼科鑷、細胞計數板、自制鼠尾膠原鋪制的培養瓶、CO2培養箱、倒置相差顯微鏡（Olympus）、超凈工作臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同取材標本對原代培養的影響：對培養條件采用正交設計進行研究[1]。如表1所示，按之前8個取材方案在2個不同標本中重復實驗1次，進入表格內按不同方案培養，即組織塊培養法+RPMI 1640培養基，組織塊培養法+DMEM培養基，膠原酶消化法+RPMI 1640培養基，膠原酶消化法+DMEM培養基。注意取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避開，要挑選活力較好的部位。予培養3、7 d觀察培養基中細胞分布情況，以組織塊周圍細胞生長來判斷原代細胞生長情況。

表1 采取正交設計的實驗方案

1.3.2 不同培養方法對原代培養的影響：對手術切取的組織分別用組織塊培養法和膠原酶消化法進行原代培養。①組織塊培養法：將手術切除的腫瘤組織放入轉移用RPMI 1640培養基（添加10倍常規抗生素的用量）中，盡快轉移到實驗室進行操作。在超凈工作臺上將癌組織取出，置于無菌平皿中，用無菌眼科剪、眼科鑷去除壞死組織、脂肪組織和血凝塊，選擇肉眼觀察瘤組織表面無潰爛的組織，將其置于15 mL離心管中，Hanks洗液沖洗去除紅細胞及表面污物。使用無菌眼科剪鑷將組織塊剪成1 mm3小塊，置于無菌塑料離心管中，用Hanks洗液重懸，吸棄上清，重復用RPMI 1640培養液重懸，清洗離心分離，吸棄上清，用滴管將小組織塊均勻地排布在培養瓶底部，先將培養瓶底朝上放置，培養一段時間后將培養瓶正放，繼續培養，以組織塊周圍有細胞生長為培養成功的標準。②膠原酶消化

法：將組織碎塊移入15 mL玻璃離心管中，加入5～10 mL IV型膠原酶消化液，放入37 ℃水浴中，不斷振蕩，連續觀察1 h，直至組織碎塊彌散開為止，收集細胞懸液，將細胞懸液通過200目無菌的不銹鋼篩網，移除大的細胞團塊，已過篩網的液體轉移入25 cm2預先鋪好鼠尾膠原的培養瓶中，于培養箱中培養。

1.3.3 不同培養基對原代培養的影響：重復1.3.2步驟，不同的是將用RPMI 1640培養基（包括轉移用RPMI 1640）處改用DMEM培養基（添加相同濃度胰島素、生長激素），培養瓶瓶底均用鼠尾膠原包被。

1.3.4 不同純化方法對原代培養的影響：對之前培養無污染且細胞絕對數量相對較多的標本進行純化。成纖維細胞的混合生長是影響腫瘤細胞生長的主要原因，因此需要去除成纖維細胞。①胰酶消化法：此法利用細胞對胰酶消化敏感性的差異，達到細胞純化的目的。國外許多學者的經驗表明，當腫瘤組織塊貼壁后，其癌細胞成片生長，形成集落，常常抑制了雜細胞的生長[2-3]，但也存在少量的雜細胞。因此，我們暫不對貼壁的細胞進行純化，當細胞培養至15～20 d后組織塊（包括無活性的腫瘤細胞、破碎細胞和成纖維細胞等）自動脫落，棄去漂浮的組織塊后對貼壁的細胞進行純化。取出培養瓶，棄掉培養基，加入5 mL PBS沖洗后，吸除PBS。加1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋轉培養瓶4～5次，使胰蛋白酶包被所有瓶內細胞，放入37 ℃細胞培養箱中2 min。取出培養瓶在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細胞首先變圓、脫落被消化下來，這時停止消化。這些首先被消化下來的細胞為成纖維細胞，吸除成纖維細胞及消化液。加入5 mL培養液，用吸管吹打細胞，收集細胞懸液。離心后棄上清。加入PBS洗滌細胞沉淀，再離心棄上清，再加入培養液繼續培養。②機械刮除法：用不銹鋼絲末端插橡膠刮頭或裹少許脫脂棉制成，高壓滅菌后備用。用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡下，刮除無標記空間；再用Hanks液沖洗1～2次，洗除被刮掉的細胞；繼續培養，如發現成纖維細胞殘留，重復刮除至完全除掉為止。③反復貼壁法：根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞分離，操作方法與傳代相同，具體如下：待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks液沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；取三個培養瓶編號為A、B、C；首先把懸液接種入A瓶中，置溫箱中靜止培養5～20 min后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，接種入B瓶后，向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；培養B瓶中培養細胞5～20 min后，按處理A瓶的方法，把培養液注入C瓶中，再向B瓶中補加完全培養基。三個培養瓶內均含有培養液，在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。

1.3.5 細胞成活率的檢查：將培養不同時間的細胞于倒置顯微鏡下進行形態學觀察，注意細胞的生長情況。必要時行細胞活力測定（采用臺盼藍染色法），確定群體細胞中存活的細胞數。

1.3.6 培養細胞的鑒定：取已處理的細胞爬片，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，H2O2去離子水孵育，以消除內源性過氧化物酶活性；滴加適當比例稀釋的一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗。采用免疫細胞化學法標記癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、上皮細胞角質蛋白20（homo sapiens keration 20，CK 20）、外周血上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）。

2 結果

2.1 不同取材標本對原代培養的影響 所有取材、轉移、組織塊處理、換液等操作均由同一位具有豐富細胞培養經驗的實驗員操作。

2.1.1 腫瘤大體類型：腫塊增生型、潰瘍浸潤型各32例。結果發現腫塊增生型腫瘤組織厚實，取材范圍大，難度相對較小，污染率低。潰瘍浸潤型腫塊易污染。腫塊增生型前3 d內8例未污染，但7 d后2例換細胞液時發生污染，4例發現雜細胞優勢生長，腫瘤細胞數量極少，2例培養出腫瘤細胞并順利傳代。潰瘍浸潤型培養大部分污染，3例起初（7 d內）未污染但14 d后換液傳代時污染2例，1例發現雜菌優勢生長。

2.1.2 腫瘤分化程度：I～II級和III～IV級各32例，各有5例和6例未污染。低分化級別短期生長可表現出明顯活力，細胞數稍多于中分化，但從長期生長結果來看未發現細胞數可明顯增多。2例培養出腫瘤細胞并順利傳代，1例分化為II級，1例分化為III級。

2.1.3 取材位置：腫瘤中央取材和腫瘤周邊取材各32例。結果發現，腫瘤中央取材腫瘤細胞容易取得壞死物而培養失敗，但如取得腫塊深部組織則細胞活力好，2例培養出滿意細胞均為腫塊增生型中央深部取材獲得。

2.2 不同培養方法對原代培養的影響 組織塊培養法進行腫瘤細胞培養，細胞一般2～3 d后從組織塊周圍爬出，見圖1。倒置顯微鏡下形態學觀察，組織塊邊緣可見有細胞游出，繼續培養待組織塊脫落純化后，可見腫瘤細胞生長，細胞呈不規則形、多角形。2例培養成功的細胞均采用組織塊培養法。膠原酶消化法培養的細胞，僅有少量細胞貼壁，繼續培養一段時間，細胞數目不理想。

圖1 組織塊培養法培養20 d可見腫瘤細胞游出

2.3 不同培養基對原代培養的影響 我們對培養3、7 d的組織塊進行了觀察，發現用RPMI 1640培養基培養的組織塊，細胞游出。而用DMEM培養基培養的組織塊，組織塊周邊發現極少量細胞游出生長，后繼續培養未能繼續生長。

2.4 不同細胞純化方法對原代培養的影響 使用機械刮除法和反復貼壁法純化細胞時，成纖維細胞清除效果不好，繼續培養后發現培養瓶中成纖維細胞又可大量生長，再培養一段時間，瓶底滿是成纖維細胞，觀察不到腫瘤細胞的生長。而胰酶消化法純化細胞能收到較好的效果，鑒定后的腫瘤細胞密度相對較高。見圖2。

2.5 培養細胞的鑒定 通過免疫細胞化學法檢測CEA、CK 20、EMA，證明培養細胞為上皮組織來源。見圖3-5。

圖2 35 d后胰酶消化法純化腫瘤細胞

圖3 CEA染色結果（×400）

圖4 CK 20染色結果（×400）

圖5 EMA染色結果（×400）

3 討論

通過大腸癌原代培養獲得的腫瘤細胞是理想的研究大腸癌腫瘤發生、發展機制的載體。但原代培養程序復雜，無菌要求嚴格，細胞生長受到培養基、操作方法、器械消毒、培養環境的無菌條件等諸多因素影響。缺乏經驗的實驗員進行細胞培養時往往會出現細胞污染率高的情況，而有經驗的實驗員往往困擾于細胞的生長活力及純化提取等階段，這其中每一階段都決定著最終實驗的成敗。

3.1 強化無菌操作 無菌操作體現在每一步細微操作中，包括玻璃瓶、培養皿、試管、移液器等的清洗、消毒、保存，培養液的配置，雙抗等試劑的添加等，任何環節出現紕漏均會使實驗帶菌，導致培養失敗，而大腸癌新鮮標本又只能做到相對無菌，因此培養基中加入有效抗生素可有效防止污染[4-6]。本實驗中，RPMI 1640培養液含青霉素和鏈霉素，DMEM細胞培養基、Hanks洗液含青霉素、鏈霉素和兩性霉素。且從本實驗結果看，腫塊增生型腫瘤組織的取材污染率相對較低，我們推測是因為腫塊取材余地大，更容易取得深部、中央部腫瘤組織，所以可以盡量避免接觸腸道細菌導致的污染。

3.2 病理取材的規范化 無污染、足夠細胞量是進行細胞培養的基本條件。切取標本應避免切取脂肪組織及壞死組織，應挑選癌細胞集中和細胞活力較好的部位。取材后應盡快送檢，不能立即送檢的標本，可將組織塊先放入細胞培養液中，置于冰浴或0～4 ℃冰箱中，以免腫瘤細胞發生自溶或凋亡。中央部取材腫瘤細胞容易取得壞死物而致培養失敗，但如取得腫塊深部組織則細胞活力好。本研究2例培養出滿意細胞均為腫塊增生型中央深部取材獲得。分化差的腫瘤細胞理論上活力應相對較好，而在實踐中，低分化腫瘤細胞短期生長可表現出明顯活力，細胞數稍多于中分化，但從長期生長結果來看未發現細胞數明顯增多，這可能與離體后細胞環境改變或營養供給不足等有關。

3.3 細胞培養方法 目前培養細胞的獲取來源有多種，國外有報道[7]稱移植瘤培養細胞系成功率高于從患者體內取得腫瘤細胞的培養方法。培養方法也有多種，國內常用的有組織塊培養法[8]和膠原酶消化法[6]。我們的實驗結果顯示組織塊培養法相對容易獲得成功。組織塊大小適中，換液前靜置，不要讓組織塊滑落漂浮，待組織塊貼壁穩定后再補加液體比較重要。培養液最好用營養較高的胎牛血清，濃度高些，加入胰島素或生長激素等促細胞生長因子。

RPMI 1640與DMEM培養基是細胞培養中常用的培養基，孰優孰劣并無定論。本實驗對培養3、7 d的組織塊進行了觀察，發現用RPMI 1640培養基培養的組織塊，細胞游出，而用DMEM培養基培養的組織塊，周邊發現極少量細胞游出生長，后繼續培養未能繼續生長。查閱文獻[9]發現HCT116、lovo、SW480和colo205等結腸癌細胞系均使用了RPMI 1640培養基。另外，培養瓶中以生長基質包被給腫瘤細胞一定的生長依賴，可以促使其更好地爬出組織塊，鼠尾膠原是不錯的選擇。

3.4 細胞的純化方法 原代培養非常容易受到成纖維細胞的污染，需及時清除。本實驗采用胰酶消化法進行細胞的純化，利用了不同細胞對胰酶的敏感性不同，成纖維細胞首先被消化下來，從而達到純化的目的，鑒定后的腫瘤細胞密度相對較高。與其他細胞純化方法相比，使用胰酶消化法花費少，實驗過程操作簡單。這可能是目前多數細胞培養實驗選擇胰酶消化法的原因。

綜上，腫瘤細胞的原代培養是非常細致和有難度的基礎工作，本實驗通過不同方法培育出2例細胞數滿意的大腸癌細胞，并對實驗結果進行了初步的分析，為繼續進行細胞培養實驗積累了有益的經驗。

[1] 張懷勤, 季亢挺, 楊德業. 內皮祖細胞培養條件的正交設計研究[J]. 溫州醫學院學報, 2005, 35(4): 261-264.

[2] Oh JH, Ku JL, Yoon KA, et al. Establishment and characterization of colorectal-carcinoma cell lines[J]. Int J Cancer,1999, 81(7): 902.

[3] Takeda A, Maeda M, Iseki H, et al. Establishment and characterization of the human SaTM-1 anal canal squamous cell carcinoma cell line derived from lymph node metastasis[J].Int J Mol Med, 2009, 24(4): 465-472.

[4] Vierck JL, Byrne K, Mir PS, et al. Ten commandments for preventing contamination of primary cell cultures[J]. Methods Cell Sci, 2000, 22(1): 33-41.

[5] Ku JL, Shin YK, Kim DW, et al. Establishment and characterization of 13 human colorectal carcinoma cell lines:mutations of genes and expressions of drug-sensitivity genes and cancer stem cell markers[J]. Carcinogenesis, 2010, 31(6):1006-1009.

[6] Failli A, Consolini R, Legitimo A, et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches[J]. Tumori, 2009, 95(3): 343-347.

[7] Virginie DM, Marc P, Sophie R, et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features[J]. Cancer Res, 2007, 67(1): 398-407.

[8] 吳海亞, 戴元榮, 尹娟. 改良組織貼塊法培養大鼠氣道平滑肌細胞[J]. 溫州醫學院學報, 2010, 40(6): 571-573.

[9] Wang XY, Lai ZS, Yeung CM, et al. Establishment and characterization of a new cell line derived from human colorectal laterally spreading tumor[J]. World J Gastroenterol, 2008,14(8): 1204-1211.