糖尿病早期大鼠血清代謝輪廓的變化

朱環(huán)，管咪咪，鄭涌泉，王娜，宋毅果，王亞強，鄧明捷，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學 藥學院代謝組學與醫(yī)藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）主要分為1型和2型[1]。1型DM是由于胰島素細胞被破壞而引起的[2]。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）能夠選擇性破壞胰島β細胞使血糖升高而出現(xiàn)臨床DM患者的癥狀。目前雖有研究DM糖類代謝物變化的報道[3]，但DM引起的整體代謝物的變化規(guī)律還不清楚。代謝組學是研究生物體內源性代謝物的整體及其受內在或外在因素影響而變化的科學[4]，非常適合疾病的代謝輪廓和發(fā)病機制研究[5]。因此本研究通過大鼠STZ造模后，再利用基于核磁共振（NMR）的代謝組學方法分析血清的整體代謝特征，這可能為闡明1型DM潛在發(fā)病機制提供重要的線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠購自上海斯萊克動物實驗有限公司，8周齡，（150±15）g，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，從早上8:00開始12 h交替照明。所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周再進行實驗。實驗期間大鼠自由飲水、進食。所有的操作程序嚴格遵守NIH的實驗動物飼養(yǎng)和使用手冊。

1.2 試劑與儀器 STZ購自Sigma-Aldrich公司；枸櫞酸、枸櫞酸鈉、水合氯醛購于上海國藥集團化學試劑有限公司；D2O（99.9%氘代）購于劍橋同位素實驗室；純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA，USA）生產(chǎn)。Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振譜儀（Bruker BioSpin International AG）；低溫離心機5415R（eppendorf Inc，Germany）。

1.3 造模方法 實驗動物分為對照組和DM組，DM組大鼠注射新鮮配制的STZ枸櫞酸鈉混懸溶液（70 mg/kg，腹腔注射），對照組大鼠給予同體積的枸櫞酸鈉混懸溶液（0.10 mol/L，pH 4.5）。給予STZ 3 d后測其血糖水平，選取血糖值大于16.70 mmol/L的大鼠作為DM大鼠。

1.4 血清樣品的制備與1H NMR譜數(shù)據(jù)的獲得 大鼠造模5周后禁食12 h，收集血液。將血液進行離心（3000 r/min，4 ℃，15 min），取上清液，保存于-80 ℃冰箱。NMR數(shù)據(jù)分析之前，血清樣品解凍，取200μL血清中加入400μL磷酸緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4/0.2 mol/L NaH2PO4，pH 7.4）以降低pH值的變化，并加入60μL含3-甲基硅烷-2，2’，3，3’-d（4）丙酸鈉（TSP）濃度為0.2 mmol/L的重水（D2O）用于鎖場。在12000 g，10 min，4 ℃條件下，離心去除樣品中的沉淀。取500μL上清液移入直徑為5 mm的NMR樣品管中。所有的1H NMR譜圖均在Bruker AVANCE III 600 MHz超導高分辨核磁共振譜儀上進行檢測，采樣溫度為25 ℃，1H的共振頻率為600.13 MHz，配有三共振探頭和Z軸的脈沖場梯度。血清樣品一維自旋回波譜用CPMG序列來采譜D-[-90°-（τ-180-τ-）n-ACQ，總的自旋回波時間2 nτ為120 ms，用于減弱轉動較慢的大分子信號，保留小分子和脂類分子的信號。64次累加和數(shù)據(jù)采集點為32 K，譜寬12000 Hz，弛豫延遲4 s；在進行傅立葉變換之前，采集的FID信號充零至64 K，并加窗函數(shù)0.3 Hz。所有的1H NMR譜圖都進行了細致的相位校正和基線調整，并參考乳酸的甲基峰（CH3，δ1.33）來定標。

1.5 NMR波譜數(shù)據(jù)處理和模式分析 為了得到全部代謝物的信息，使用Bruker Topspin 2.1軟件包對采集的1H NMR譜進行相位校正和基線調整，將1H NMR譜從δ10.0～0.4 ppm分別按0.01 ppm和0.0015 ppm為單位進行自動分段積分，為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，將δ5.2～4.4 ppm區(qū)域設為0積分段。為補償樣品之間濃度的差異，對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將以0.01 ppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導入SIMCAP+12.0軟件包（瑞典Umetrics公司），進行多元統(tǒng)計分析。偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）的所有的樣品點都展示在第一和第二個主成分（PC1和PC2）為x、y坐標軸的二維空間中，該圖中的每一個點都代表一個血清樣品。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 歸一化后的積分值導入SPSS 13.0軟件作統(tǒng)計學分析。兩組樣品間的比較采用獨立樣品的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模結果 對照組生長發(fā)育良好，而DM組大鼠體質量明顯下降；對照組大鼠精神狀態(tài)良好，被毛潔白有光澤，DM組被毛粗糙發(fā)黃，黯淡無光澤；對照組大鼠的食量、飲水量、尿量與實驗前相比無明顯變化，而DM組大鼠明顯出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，并且飲水量和食量都明顯增加，為保證其飲水量的充足，一天需要多次加水。造模成功后，每周我們都對大鼠的隨機血糖進行檢測，對照組大鼠血糖在正常范圍內，波動少，而DM組大鼠的隨機血糖均大于16.7 mmol/L，并且隨著時間推移血糖日益升高。直至造模后第5周，剩余對照組大鼠數(shù)量n=7，DM組大鼠數(shù)量n=7。

2.2 血清1H NMR圖譜的分析 圖1是典型的對照組大鼠和DM大鼠血清的1H CPMG譜，圖中標注的代謝物是通過結合文獻[6]報道，chemx6.0軟件以及我們已有的實驗基礎[5]完成的。我們檢測了以下代謝物：甲酸（formate，δ8.45），苯丙氨酸（phenylalanine，δ7.37），酪氨酸（tyrosine，δ7.18），組氨酸（histidine，δ7.07），α-葡萄糖（α-glucose，δ5.23），β-葡萄糖（β-glucose，δ4.65），甘油（glycerol，δ3.68），甘氨酸（glycine，δ3.56），膽堿（choline，δ3.22），肌酸（creatine，δ3.03），天冬氨酸（aspartate，δ2.87），枸櫞酸（citrate，δ2.53），谷氨酰胺（glutamine，δ2.44），N-乙酰糖蛋白（NAG，δ2.02），氧化三甲胺（TMAO，δ3.26），丙酮酸（pyruvate，δ2.37），3-羥基丁酸（3-HB） （3-hydroxybutyrate，δ2.30），乙酰乙酸（acetoacetate，δ2.28），丙酮（acetone，δ2.23），乙酸（acetate，δ1.91），丙氨酸（alanine，δ1.47），乳酸（lactate，δ1.33），纈氨酸（valine，δ1.03），異亮氨酸（isoleucine，δ1.00），亮氨酸（leucine，δ0.96），低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL，δ0.86）。

2.3 模式識別分析結果 如圖2，我們從PLS-DA得分圖上可以發(fā)現(xiàn)DM大鼠與對照組大鼠血清樣品在第一主成分上能明顯區(qū)分開（見圖2A，R2=87.8%，Q2=78.4%），因此推測DM大鼠與對照組大鼠的代謝輪廓是不同的。從相對應的載荷圖（見圖2B）可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、膽堿、肌酸、乳酸、3-HB、LDL/VLDL對兩組的區(qū)分貢獻較大。

圖1 對照組大鼠(A)和DM大鼠(B) 血清典型的1H CPMG NMR譜

圖2 模式識別分析結果

2.4 統(tǒng)計學分析結果 相比對照組大鼠，DM大鼠中β-葡萄糖和甘油水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；而酪氨酸、甘氨酸、膽堿、谷氨酰胺、丙酮酸、3-HB、乳酸、丙酮和LDL/VLDL顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），其他代謝物組間差異不存在統(tǒng)計學意義。詳見表1。

3 討論

表1 對照組和DM組大鼠t檢驗統(tǒng)計學分析結果

DM的病理生理機制比較復雜，其疾病基礎是糖代謝紊亂、血流動力學異常、胰島素抵抗和炎性遞質活化，但是關于其發(fā)病機制仍知之甚少。研究表明1型DM動物缺乏胰島素，因而導致對葡萄糖攝取和利用不足[7]。在本研究中，與對照組大鼠相比，DM早期大鼠β-葡萄糖含量明顯升高（血糖明顯升高的重要原因），推測是由于機體對葡萄糖等營養(yǎng)物質的攝取利用不足所造成的，說明DM大鼠的糖代謝紊亂，符合DM的已知病因和診斷[8]。以上觀點從3-HB的降低得以印證，當葡萄糖來源受限時，3-HB將被作為一種能源替代物[9]，它能夠作為能量物質以應對DM機體對葡萄糖利用的不足。此外，為了應對葡萄糖利用不足而導致的能量缺乏，乳酸會被氧化成丙酮酸而進入三羧酸循環(huán)（TCA），從而提供大量的能源，這可能就是DM大鼠乳酸顯著性降低的原因之一。丙酮酸，作為重要的糖酵解產(chǎn)物，能被轉化為乙酰輔酶A進而參與TCA。本研究中觀察到DM大鼠丙酮酸顯著性降低，反映出DM早期大鼠TCA程度會增強，從而導致丙酮酸的大量消耗，加速機體將蛋白質和脂肪轉換為丙酮酸。能源物質利用的不足，加之TCA程度的增強而致機體能量大量流失，正是DM大鼠機體迅速消瘦的重要原因。

甘氨酸為體內非必需氨基酸，由葡萄糖轉變而來，本研究中發(fā)現(xiàn)DM大鼠甘氨酸顯著性降低，這可能正是機體對葡萄糖的利用不足所致。谷氨酰胺是人體含量最豐富的氨基酸，作為糖代謝和氨基酸代謝的重要中間體，谷氨酰胺能夠減輕急性腎小管損傷[10]。因此，其濃度降低反映出DM早期機體能為減輕高血糖腎損傷而做出反應。含苯基的化合物主要是由腸道內的菌群代謝產(chǎn)生（如酪氨酸），主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出來[11]，酪氨酸的減少表明DM大鼠腸道內的菌群代謝發(fā)生紊亂。另外，DM大鼠在飲食、消化、吸收各方面受到影響，這可能也是各種氨基酸含量普遍降低的原因[12]。

膽堿是細胞膜的組成成分并參與脂類代謝[13]。DM大鼠膽堿的降低，可能由于DM發(fā)病過程中的炎癥反應導致機體細胞再生受到抑制。甘油主要的產(chǎn)生器官是肝臟，巨噬細胞和血管平滑肌細胞能夠將其吸收并清除[14]，DM大鼠甘油的顯著性降低，是由于體內產(chǎn)生大量的巨噬細胞對DM炎癥做出的保護性反應。DM大鼠血清中LDL/VLDL含量減少，這提示DM肝細胞內正常的脂類代謝被破壞。然而也有文獻報道LDL/VLDL含量在DM中是升高的[7]，這可能是由于其檢測的樣品是尿液或者動物處于不同的DM時期所致。酮體包括丙酮、乙酰乙酸和3-HB，也是脂肪酸的代謝產(chǎn)物。實驗中我們觀察到DM大鼠丙酮和3-HB顯著性降低，這與文獻[15]報道的Zucker肥胖大鼠代謝結果一致。這些酮體濃度降低提示了DM導致的線粒體功能障礙會引起脂肪酸氧化作用紊亂。

本研究應用代謝組學方法展示了DM早期大鼠血清的代謝物變化，揭示了其糖代謝、氨基酸代謝以及脂類代謝發(fā)生紊亂的分子機制，這為進一步研究DM的代謝特征提供了線索。

[1] 張瑩瑩, 于捷, 周旋, 等. 復方降糖茶對STZ 誘導的糖尿病大鼠的治療作用及其可能機制[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2011, 41(3): 224-227.

[2] Li Y, Hamasaki T, Teruya K, et al. Suppressive effects of natural reduced waters on alloxan-induced apoptosis and type 1 diabetes mellitus[J]. Cytotechnology, 2012, 64(3): 281-297.

[3] Zhang X, Wang Y, Hao F, et al. Human serum metabonomic analysis reveals progression axes for glucose intolerance and insulin resistance statuses[J]. J Proteome Res, 2009, 8(11): 5188-5195.

[4] 夏建飛, 梁瓊麟, 胡坪, 等. 代謝組學研究策略與方法的新進展[J]. 分析化學, 2009, 37(1): 136-143.

[5] Gao H, Dong B, Liu X, et al. Metabonomic profiling of renal cell carcinoma: high-resolution proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of human serum with multivariate data analysis[J]. Anal Chim Acta, 2008, 624(2): 269-277.

[6] Zhang H, Jia J, Cheng J, et al.1H NMR-based metabonomics study on serum of renal interstitial fibrosis rats induced by unilateral ureteral obstruction[J]. Mol Biosyst, 2012, 8(2):595-601.

[7] Zhao L, Gao H, Lian F, et al.1H-NMR-based metabonomic analysis of metabolic profiling in diabetic nephropathy rats induced by streptozotocin[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2011, 300(4): 947-956.

[8] 孫永寧, 馮雯, 劉忠. 糖尿病腎陰虛證模型大鼠血液標本的代謝組學研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學學報, 2010, 34(1): 80-82.

[9] Lei R, Wu C, Yang B, et al. Integrated metabolomic analysis of the nano-sized copper particle-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity in rats: a rapid in vivo screening method for nanotoxicity[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 232(2): 292-301.

[10]Hu YM, Pai MH, Yeh CL, et al. Glutamine administration ameliorates sepsis-induced kidney injury by downregulating the high-mobility group box protein-1-mediated pathway in mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2012, 302(1): 150-158.

[11]Nowak A, Libudzisz Z. Influence of phenol, p-cresol and indole on growth and survival of intestinal lactic acid bacteria[J]. Anaerobe, 2006, 12(2): 80-84.

[12] 尤麗, 巴吐爾·買買提明, 哈木拉提·吾甫爾. 基于核磁共振的腎虛痰瘀型2型糖尿病患者血清代謝組學研究[J].科技導報, 2012, 30(8): 25-29.

[13]Sun YJ, Wang HP, Liang YJ, et al. An NMR-based metabonomic investigation of the subacute effects of melamine in rats[J]. J Proteome Res, 2012, 11(4): 2544-2550.

[14]Kwan BC, Kronenberg F, Beddhu S, et al. Lipoprotein metabolism and lipid management in chronic kidney disease[J].J Am Soc Nephrol, 2007, 18(4): 1246-1261.

[15]Zhao X, Dey A, Romanko OP, et al. Decreased epoxygenase and increased epoxide hydrolase expression in the mesenteric artery of obese Zucker rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005, 288(1): 188-196.