不同劑量地塞米松對SD大鼠骨代謝的影響

陜西省榆林市第二醫院（榆林719000） 高不為

糖皮質激素是一種在臨床上應用廣泛的激素，可廣泛用于炎癥、風濕及器官移植后產生的排斥反應［1，2］。但大劑量長期使用糖皮質激素，會產生明顯的不良反應。特別是對骨骼產生的影響，最嚴重時會造成糖皮質激素性骨質疏松，導致發生病理性骨折的危險大增［3］。目前研究骨質疏松的作用機制已經深入到細胞和分子水平，仍然有很多問題需繼續深入研究。實驗證明不同劑量的地塞米松在體外對骨骼產生的影響不同［4］。門冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶（Caspases）存在于胞質溶膠中，是一組結構相關半胱氨酸蛋白酶，對介導細胞凋亡的過程有非常重要的作用。Caspase－3是Caspase家族成員中研究最多的一種半胱氨酸蛋白酶，功能相對明確，其活化的程度反映了凋亡發生的強弱［5，6］。本組觀察應用不同劑量地塞米松對大鼠骨生物指標、成骨細胞調亡及Caspase－3表達產生的影響，初步探討地塞米松對實驗動物骨代謝的影響機制，從而為提出相關預防措施提供理論依據。

材料與方法

1 動物與分組 將3月齡的雌性SD大鼠40只隨機分為四組：對照組（10只），地塞米松（美國內布拉斯加大學藥學院）低劑量組（1mg／kg，10只），地塞米松中劑量組（2．5mg／kg，10只），地塞米松高劑量組（5 mg／kg，10只），尾靜脈注射，2次／周。連續給藥8周，在動物處死前前3天或者前4天頸部皮下注射鈣黃綠素（美國Sigma公司）進行體內雙熒光標記。飼養室溫24～28℃，濕度50%～60%，分籠飼養。

2 骨生物指標測定 取四組大鼠的第5腰椎（L5）與第3腰椎（L3），剔除周圍組織與肌肉，生理鹽水沖洗后用錫紙包裹，裝代－20℃凍存，L3進行骨礦含量測定；L5剪去腰椎椎弓打磨后，進行壓縮力學實驗，檢測最大載荷值。

3 成骨細胞培養 四組大鼠引頸法處死后，75%酒精浸泡消毒10min。將腰椎骨剪成大小約1mm2的小塊，加入0．25%胰蛋白酶消化約15min；終止消化3d后換液，7～10d后待細胞鋪滿瓶底約80%后再傳代培養。

4 細胞凋亡檢測與Caspase－3活性檢測 將成骨細胞接種于6孔培養板，6孔培養板中放置有無菌蓋玻片，使細胞貼壁生長，分別加入含不同濃度藥物的培養基，分別于24h、48h、72h每組隨機選取3個樣本，進行熒光染色，以紫外光340nm波長激發，熒光顯微鏡下觀察計數；每個樣本隨機選取三個視野計數總細胞數和凋亡細胞數，算出凋亡率（凋亡率＝凋亡細胞／細胞總數X100%），樣本凋亡率取三個視野凋亡率的平均值。同時用Caspase－3分光光度法檢測試劑盒檢測 Caspase－3活性。

5 統計學處理 本組結果統計數據以SPSS18．0軟件分析，骨生物指標以及成骨細胞調亡及Caspase－3表達數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對比 見表1。隨著地塞米松濃度的增加，骨礦含量逐漸降低，但組間無顯著性差異（P＞0．05），而地塞米松低劑量組的最大壓縮載荷明顯少于其他三組（P＜0．05）。

2 凋亡率對比 見表2。經過觀察，與對照組對比，地塞米松三組成骨細胞的凋亡率均明顯增加（P＜0．05），低劑量組的凋亡率少于中劑量組與高劑量組（P＜0．05）。

3 不同組別成骨細胞Caspase－3活性對比 見表3。與對照組對比，地塞米松三組成骨細胞的Caspase－3活性均明顯增加（P＜0．05），低劑量組的Caspase－3活性少于中劑量組與高劑量組（P＜0．05）。

表1 不同組別的腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對比（±s）

表1 不同組別的腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對比（±s）

組 別 骨礦含量（g） 最大壓縮載荷（N）對照組 0．12±0．01 214±30地塞米松低劑量組 0．11±0．02 179±51中劑量組 0．09±0．02 204±21高劑量組 0．08±0．03 209±53 F 值 0．962 3．621 P 值 0．088 0．018

表2 不同組別對成骨細胞凋亡率的影響（%，±s）

表2 不同組別對成骨細胞凋亡率的影響（%，±s）

組 別不同處理時間的凋亡率24h 48h 72h對照組 0．78±0．12 0．79±0．12 0．79±0．12低劑量組 1．75±0．84 2．27±1．13 2．39±1．32中劑量組 2．00±0．20 6．75±0．25 7．08±0．56高劑量組 2．88±0．20 7．27±1．13 7．39±0．52 F 值 12．658 18．965 14．328 P 值 0．000 0．000 0．000

表3 不同組別對成骨細胞Caspase－3活性的影響（±s）

表3 不同組別對成骨細胞Caspase－3活性的影響（±s）

組 別不同處理時間的Caspase－3活性24h 48h 72h對照組 0．09±．01 0．09±0．01 0．10±0．01低劑量組 0．12±0．02 0．20±0．01 0．18±0．01中劑量組 0．16±0．03 0．26±0．06 0．27±0．01高劑量組 0．19±0．03 0．29±0．02 0．30±0．02 F 值 6．215 10．009 12．526 P 值 0．003 0．000 0．000

討 論

當前雖然在臨床上地塞米松的使用越來越多，但是對于骨質疏松的影響也越來越大。近年的研究發現，使用地塞米松4周的小鼠成骨細胞凋亡增加3倍，28%的皮質骨干骺端骨細胞凋亡［7］。另外地塞米松性骨質疏松患者成骨細胞和破骨細胞凋亡均有增加［8］。另外還有學者證實了地塞米松能夠誘導原代分離培養的成骨細胞發生凋亡，而且這種效應呈藥物濃度和時間依賴性［9］。

我們知道，骨質量的好壞決定于骨量的多少、骨組織的功能這兩個方面的合理構成，腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷能較好地反映骨骼的內在力學性能。因此，能直觀觀察并定量分析腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷，再結合反應骨強度的生物力學實驗能夠更好地分析和評價骨質量的狀態［10］。本組結果顯示：隨著地塞米松濃度的增加，骨礦含量逐漸降低，而地塞米松低劑量組的最大壓縮載荷明顯少于其他三組。說明不同劑量的地塞米松顯著抑制骨形成，并且有劑量依賴性。雖然腰椎骨量不減，骨力學性能改變不大。

骨骼生長、更新和修復過程包括成骨細胞主導的骨形成過程以及破骨細胞調節的骨吸收過程［11］。正常情況下，骨骼系統中骨形成和骨吸收之間處于動態平衡，許多疾病的發生，就是由于失去了這種動態平衡，而出現骨吸收速度超過骨形成速度所致，導致骨細胞數量減少［12，13］。證實激素的作用主要是誘發成骨細胞和骨細胞凋亡，骨組織生成減少，更新率降低，凋亡持續發展，引起股骨頭壞死。本組觀察到地塞米松三種劑量組成骨細胞的凋亡率均明顯增加，低劑量組的凋亡率少于中劑量組與高劑量組，證實了地塞米松能夠誘導原代分離培養的成骨樣細胞發生凋亡，而且這種效應呈藥物濃度和時間依賴性。同時本研究也觀察到地塞米松三組成骨細胞的Caspase－3活性均明顯增加，低劑量組的Caspase－3活性少于中劑量組與高劑量組。說明地塞米松可以通過激活Caspase－3而引起成骨細胞的凋亡，即Caspase－3在地塞米松誘導的成骨細胞凋亡中扮演重要角色。

總之，地塞米松的應用能降低骨生物學質量，誘導成骨細胞凋亡，Caspase－激活是一條主要途徑，而小劑量的應用對于這種影響比較小。

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