白藜蘆醇對小鼠輻射氧化損傷的保護性研究※

北京協和醫學院、中國醫學科學院放射醫學研究所天津市分子和醫學重點實驗室（天津300192）

李程程 張 恒 吳紅英 王營營 黃 頌 張珠博 孟愛民▲

白藜蘆醇（Resveratrol，Rev）是一種非黃酮多酚類化合物，化學名為3’5’4’－三羥基反－二苯代乙烯（3’5’4’－trihydroxy－trans－stilbene），分子量228．24，分子式為C14H12O3，主要來源于蓼科植物虎杖（Polygonumcuspidatum）的根莖提取物，廣泛存在于葡萄、花生等植物中。Rev作為一種多酚類化合物，可以清除羥自由基、過氧化物和氧自由基，其抗氧化損傷主要是通過上調細胞內抗氧化酶活力［1］。對大鼠心肌細胞和人靜脈血管內皮細胞的研究表明，Rev可以上調超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Catelase）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutamthione peroxidase，GPX）的活力［2，3］，Rev還可以在人靜脈血管內皮細胞中下調內原ROS生成酶NOX4的表達［2］。因為Rev具有的這些作用，我們進一步探討了Rev輻射損傷的防護作用及其機制。

材料與方法

1 試劑與設備 過氧化氫檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，產品編號：S0051），Cu／Zn－MnSOD檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，產品編號：S0105 伽馬射線輻照儀（ExposureInstrument Gammacell－40加拿大 Atomic Energy公司），Rev由中國醫學科學院藥物研究所候琦教授提供，多功能酶標儀（Infinite200瑞士Tecan公司），臺式低溫高速離心機5810R（Eppendorf），ficoll淋巴細胞分離液（天津美德太平洋有限公司。

2 動物與分組 選取16只C57BL／6小鼠（來源：C57BL／6雄性小鼠SPF級由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證號［SCXK（京）2005－0013］，體重20．0～22．0g，周齡8～12周，隨機分為對照組（Control），照射組（IR），單獨給藥組（Rev）和照射給藥組（Rev＋IR），每組4只。對照組不做特殊處理，IR組和Rev組小鼠接受亞致死劑量（6Gy）的全身照射，Rev組和Rev＋IR組用Rev干預，照射前7天至照射后30天灌胃給Rev（20mg／kg·day）。照射后30d，小鼠取外周血，每只小鼠抗凝管收集至少500μl外周血，2000rpm，4℃離心，分離血漿和血細胞，離心管收集上層血漿。取骨髓細胞Ficoll分離后收集單個核細胞。血漿和單個核細胞作為實驗樣本－80℃保存待后續檢測。

3 生化指標測定 利用過氧化氫酶檢測試劑盒檢測骨髓單個核細胞和血液中的過氧化氫酶活性。利用Cu／Zn－MnSOD檢測試劑盒檢測血漿中SOD酶活性。各項指標的測定均按照試劑盒說明書進行測定。

4 統計學處理 本組數據采用SPSS16．0軟件進行統計分析，應用多個樣本均數比較的方差分析檢驗，數據以均數±標準差（±s）表示，并用最小顯著差法（LSD法）作兩兩比較，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 各組小鼠血漿中總SOD活性比較 見表1。照射組小鼠血漿中SOD活性明顯降低（P＜0．05），說明照射對總SOD影響較大；單獨給藥組與對照組比較差異不大，說明Res單獨給藥對總SOD有影響，但無顯著性差異（P＞0．05）。照射給藥組總SOD活性與照射組相比明顯升高（P＜0．05）。提示Res可以提升照射后小鼠血漿中總SOD活力，具有抗氧化作用。

2 各組小鼠血漿中Mn－SOD活性比較 見表1。照射組小鼠血漿中 Mn－SOD活性明顯降低（P＜0．05），說明照射對Mn－SOD有顯著影響；單獨給藥組的Mn－SOD活性與對照組比較明顯下降（P＜0．05）。說明Res可以降低Mn－SOD的活性。照射給藥組SOD活性與照射組相比升高不明顯，提示Res對照射后小鼠血漿中Mn－SOD影響不顯著。

3 各組小鼠血漿中CAT活性比較 見表2。照射組小鼠血漿中CAT活性與對照組相比沒有明顯變化，提示照射后1個月CAT活性有所恢復。單獨給藥組與對照組比較CAT活性明顯增加（P＜0．05）。說明Res可以提高血漿中CAT的活性。照射給藥組CAT活性與照射組相比明顯升高（P＜0．005）。提示Res可以明顯提升照射后小鼠血漿中CAT活力，具有抗氧化作用。射組小鼠骨髓單個核細胞中CAT活性與對照組相比并無顯著性差異（P＞0．05），提示照射1個月后小鼠骨髓單個核細胞中CAT活性有所恢復。單獨給藥組與對照組比較CAT活性明顯增加 （P＜0．05）。說明Res可以提高骨髓單個核細胞中CAT的活性。照射給藥組CAT活性與照射組相比明顯升高 （P＜0．005），提示Res可以明顯提升照射后小鼠血漿中CAT活力，具有抗氧化作用。

表1 白藜蘆醇對輻射誘導的小鼠血漿中總SOD和Mn－sod的活力影響（±s，n＝4）

表1 白藜蘆醇對輻射誘導的小鼠血漿中總SOD和Mn－sod的活力影響（±s，n＝4）

注：※ 與對照組比較，P＜0．05；△與照射組比較，P＜0 05

組 別 總SOD活力（U／ml）Mn－SOD活力（U／ml對照組 104．85±25．37 102．15±13．24）照射組 71．14±19．71※ 77．24±6．78※Res組 91．16±11．76 79．77±6．58※照射＋Res組 93．60±2．22△ 79．25±12．73

表2 白藜蘆醇對輻射誘導的小鼠血漿和骨髓單個核細胞中CAT活性的影響（±s，n＝4）

表2 白藜蘆醇對輻射誘導的小鼠血漿和骨髓單個核細胞中CAT活性的影響（±s，n＝4）

注：※ 與對照組比較，P＜0．05；＃與照射組比較，P＜0 05；△與Res組比較，P＜0．05

組 別 血漿中CAT活性（105 U／ml）骨髓單個核細胞中CA活力（105 U／ml）對照組 2．337±0．652 1．892±1．101 T照射組 2．358±0．182 1．892±1．101 Res組 3．383±0．823※ 2．407±0．499※照射＋Res組 3．026±40．839＃ 2．116±0．173＃△

討 論

Rev作為保健品已經廣泛運用于多種疾病的預防，在神經系統、心血管系統疾病治療的臨床研究也已經得到廣泛的開展，但作為輻射損傷防護劑卻鮮有報道。近期Wang等［4］研究表明：小鼠接受亞致死劑量的TBI，可以使HSC中NOX4高表達，生成ROS而導致HSC衰老并導致骨髓造血功能衰竭。Rev是一種強效的抗氧化劑，可以通過調節多種基因的表達降低組織中 ROS水平［5，6］。

近期，Zhang等［7～9］通過研究 Res保護 TBI小鼠的骨髓造血功能衰竭是通過緩解氧化應激。白藜蘆醇通過下調NOX4的表達，上調SOD2和GPX1的mRNA表達，從而降低HPC和HSC中ROS的水平而起到對造血系統輻射損傷的保護作用［7］。而機體內存在一系列抑制和清除自由基的抗氧化酶和非酶系統，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）、谷胱甘肽轉移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）等。其中SOD可與自由基發生歧化反應，對機體的氧化、抗氧化平衡起著至關重要的作用，可以保護組織細胞免受損傷。CAT是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶，起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。上述酶活力的高低間接反應了機體清除氧自由基能力大小。

本組使用TBI小鼠模型研究了Rev對IR導致造血細胞損傷防護作用的研究，對接受亞致死劑量全身照射的小鼠長期低劑量灌胃使用白藜蘆醇。結果表明，外周血血漿中Cu／Zn－SOD和總SOD活性給藥后與對照組相比可以有效的提高，促進其抗氧化活性。骨髓單個核細胞和血漿中，照射給藥組與照射組相比，CAT的活性也顯著地提高。說明白藜蘆醇可以提高抗氧化酶活性行使其抗氧化作用。這些實驗結果進一步從蛋白水平上說明了白藜蘆醇可以提高輻射損傷小鼠血漿中總SOD和CAT活性，提高骨髓單個核細胞中CAT的活性。也進一步說明Rev可以通過提高抗氧化酶活性來達到輻射保護作用。

Rev是一種天然植物的提取物，成本低、毒性低，已經廣泛應用于保健食品中，所以相比其他抗氧化劑在臨床上具有更廣泛地運用前景。在我們的研究中，小鼠輻射暴露前就給予Rev干預，所以對TBI后Rev的治療作用還未能闡明，今后的研究將探討輻射暴露后Rev的輻射損傷治療作用。

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