抗腫瘤藥山豆根毒性實驗

摘要：目的 通過山豆根水煎液對小鼠灌胃，觀測其毒性反應，對其臨床療效和安全性進行評估，為臨床用藥提供參考。方法 連續(xù)14d給小鼠灌胃山豆根水煎液，觀察小鼠狀況，計算其半數致死量（LD50），另取小鼠按不同時間點分組，測量體重變化，測定血液生化指標，分別計算肝臟指數。結果 山豆根水煎液灌胃給藥的LD50為16.4686g/kg，LD50的95%可信限為14.7501～17.6027g/kg，給藥后第l天山豆根水煎液未對小鼠肝臟造成明顯損傷，連續(xù)給藥14天后小鼠出現體重增長緩慢，血清中ALT、AST活性升高，TBil含量升高，ALB含量下降，肝臟指數增大，上述變化隨給藥時間的延長而加重。結論 長期給小鼠灌胃山豆根水煎液可造成明顯的肝損傷。

關鍵詞：山豆根；抗腫瘤；毒性實驗

中圖分類號：R99 文獻標識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）5-027-02

山豆根（Radix et Rhizoma Sophorae Tonkinensise）為豆科槐屬植物越南槐的干燥根莖，主產于廣西、貴州，又名廣豆根、苦豆根、柔枝槐、山大豆根等。其主要成分為生物堿、黃酮、皂苷、多糖等，山豆根提取物對體腫瘤細胞的生長有較好的抑制作用，其水體物和醇提物均能抑制多種腫瘤細胞生長。被認為對腫瘤有特殊的治療價值。另外，山豆根具有抗肝炎、抗肝損傷、抗病毒活性等作用。隨著山豆根的廣泛使用，其臨床不良反應報道亦日益增多，尤其是發(fā)現肝、腎毒性的報道日漸增多，本實驗旨在對該藥的毒性作用進行較為系統的研究，為抗腫瘤藥的合理應用和安全性奠定文獻基礎并提供新的評價依據。

1 儀器與材料

1.1藥材及制備

1.1.1山豆根水煎液的制備：

取山豆根藥材1kg，加10倍量的水浸泡0.5h，武火煎煮，水沸騰后改為文火煎煮30min，過濾藥液，藥渣再加3倍量的水，按上述煎法，煎煮完畢過濾藥液，合并兩次濾液，濃縮至2.5g/ml，置于冰箱冷藏室中，備用。

用時按照需要劑量折算后，按等體積不同濃度原則配置。

1.2實驗動物

健康成年小鼠，SPF級，雌雄各半，體量18～22g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（豫）2005-0001。

飼養(yǎng)條件：室溫24±2℃，相對濕度40～70%，動物飼以全價營養(yǎng)顆粒飼料，飲用水為無菌水，自由飲食及飲水。實驗前先喂養(yǎng)7天，為適應期。

1.3實驗主要儀器

金諾JF1204電子天平：深圳華恒儀器有限公司產品

BM830全自動血細胞分析儀：泰安市泰諾科貿有限公司產品

UV754紫外可見分光光度計：日本島津公司產品

L320生物顯微鏡：深圳西派克光學儀器有限公司生產產品

單道可調式移液器：廣州雷得生物技術有限公司產品

GL—20B高速冷凍離心機：上海安亭儀器設備有限公司

1.4實驗試劑

白蛋白（ALB）試劑盒（批號：20101027）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號：20100922）；天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號：20101027）；總膽紅素（TBil）試劑盒（批號：20090614），均購自上海銳谷生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1半數致死量（LD50）的測定

2.1.1山豆根組小鼠灌胃給藥半數致死量（LD50）的測定：

首次預實驗：取15只小鼠，雌雄各半，按體質量、性別分層隨機法分為3組，每組5只。以20.54g·kg-1為預試1組劑量，按劑量等比級數1∶0.5計算，得到預試2組劑量為10.27g·kg-1、預試3組劑量為5.14g·kg-1。禁食（不禁水）12h后，各組均按25ml/kg灌胃，給藥后記錄動物的即時反應并連續(xù)觀察2d，結果不能確定小鼠死亡率（P）為0%的劑量（Dn），因此須進一步確定小鼠死亡率（P）為0%的劑量（Dn）。

二次預實驗：取15只小鼠，雌雄各半，按體質量、性別分層隨機法分為3組，每組5只，以5.14g·kg-1為最高灌胃劑量，劑量等比級數為1∶0.5，依次取3個濃度給3組小鼠，分別為5.14，2.57，1.29g·kg-1，各組灌胃1次后觀察2d。綜合2次預試結果，以5.14g·kg-1的劑量灌胃后，P=1；以1.29g·kg-1的劑量灌胃后，P=0。由此，山豆根水煎液Dm約為5.14g·kg-1，Dn約為1.29g·kg-1。見下表。

綜合兩次預試結果，推測小鼠灌胃山豆根水煎液的死亡率（P）為0%的劑量（Dn）為1.29g·kg-1，小鼠P為100%的劑量（Dm）為5.14g·kg-1。

正式實驗：取60只健康小鼠，隨機分為6組，其中5組為給藥組，1組為對照組，雌雄各半，實驗前禁食12h，正常飲水，根據預試驗結果中LD0和LD100劑數量，測定組間劑量比值為1：0.76。取配成一定濃度的山豆根水煎液，并設置溶劑對照組，給藥組按25ml/kg的給藥體積對小鼠進行灌胃，對照組同時灌胃等體積蒸餾水，給藥后觀察2d；觀察并記錄動物給藥后一般狀況和死亡情況，計算LD50及LD50的95%水平的置信區(qū)間。

山豆根組小鼠灌胃給藥半數致死量（LD50）的結果，見下表。

用Bliss法程序計算得山豆根組小鼠灌胃給藥半數致死量LD50為16.4686g/kg，LD50的95%可信限為14.7501～17.6027g/kg。

2.2藥物毒性的對照

2.2.1實驗動物分組及給藥：

健康小鼠30只，雌雄各半，隨機分為2組，分別為空白組、山豆根水煎液組，每組15只，各組動物按25ml/kg每日灌胃一次，空白組給以等量的蒸餾水，連續(xù)給藥14天，給藥期間動物自由攝食飲水。未次給藥后一定時間，動物禁食不禁水12小時，每組隨機抽取小鼠8只，取血進行血生化檢測，取血后小鼠處死作系統尸檢和病理組織學檢查。

2.2.2小鼠給藥后一般情況觀察：

給藥期間每日觀察記錄小鼠毛色、活動、精神狀態(tài)、進食飲水、大小便等一般情況及出現的毒性癥狀、體征；小鼠定時稱重，記錄給藥期體重變化。稱重間隔根據各組分給藥時間確定，定時檢測小鼠日食量、水量變化，檢測時間間隔根據各組分給藥時間確定。

2.2.3小鼠給藥后血液生化學檢查：

眼眶靜脈叢取血，3000r·min-1，4℃離心10min，用移液器取上層血清，以全自動生化分析儀測定血清中ALB、ALT、AST和TBil。

2.2.4計算肝臟指數并觀察小鼠重要組織病理學變化：

摘肝臟并稱重量，計算肝臟指數。

3 實驗結果

3.1半數致死量（LD50）的計算

實驗結束后，將所得數據用Bliss法程序計算得山豆根水煎液組小鼠灌胃給藥半數致死量LD50為16.4686g/kg，LD50的95%可信限為14.7501～17.6027g/kg。

3.2給藥后小鼠一般狀況觀察結果

通過觀察，實驗期間空白對照組的小鼠活動、毛色、精神狀況、進食飲水、大小便等一般情況均正常。山豆根組小鼠在給藥期間體重增長緩慢，給藥后第8天觀察，山豆根組小鼠部分出現狂躁、多動、精神不佳、毛色較差、體重增長緩慢等特點，給藥后14天山豆根組小鼠體重與空白對照組比較呈顯著性差異，隨給藥時間的延長體重差異增大；山豆根組小鼠在給藥期間日攝食量逐漸減少；山豆根組小鼠在給藥期間日水量增加緩慢。給藥期間體重測定見下表。

3.3給藥后小鼠血清生化學檢測結果

提取各組小鼠眼眶靜脈血清，進行血液生化學檢查，結果進行組間t檢驗，見表6。

結果表示，藥后14天，空白對照組的小鼠血清中白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBil）活力均在正常范圍內；小鼠灌胃山豆根水煎液14天，可使小鼠血清中的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBil）活性均明顯升高，白蛋白（ALB）含量稍有降低。

4 討論

半數致死量（LD50）是對藥物毒性大小的粗略估計，是評價藥物優(yōu)劣的重要參數。LD50與藥物毒性成反比，即致死量越小，毒性越大；致死量越大，毒性越小。本次實驗測得的數據說明，作為抗腫瘤用藥，山豆根的藥物毒性較大，且毒性損傷集中在肝臟。

小鼠血清中ALT、AST、TBil等指標與肝毒性損傷具有很強的相關性，可作為評價中藥致肝毒性損傷的一級篩選指標，此次實驗結果中可看出，山豆根給藥組小鼠的ALT、AST、TBil含量升高，說明山豆根可引起肝毒性損傷。

本實驗對抗腫瘤藥物山豆根的藥物毒性進行了探討，通過藥物毒性評價，為藥物的合理應用和進一步研究提供了必要的參考。

參考文獻：

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