水產(chǎn)品體內(nèi)血、肝、腎、肌肉中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物的測定研究

摘 要：研究了恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在水產(chǎn)品各組織（血、肝、腎、肌肉）的提取、凈化方法，建立了一套水產(chǎn)品血、肝、腎、肌肉中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星準確、簡便的測定方法。并應用該套測定方法初步研究了中華鱉中恩諾沙星的代謝規(guī)律。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星；環(huán)丙沙星；測定；代謝規(guī)律

中圖分類號 S9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）01-02-116-02

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）為第3代喹諾酮類藥物，屬廣譜抗菌藥，抗菌力強，與其它抗菌藥無交叉耐藥性等特點，可用于治療多種細菌感染性疾病， 目前廣泛應用于水產(chǎn)動物病害防治[1]。近年來國內(nèi)陸續(xù)有部分水產(chǎn)品（中華絨螯蟹、青蟹、羅氏沼蝦、鯉魚[2-7]）中恩諾沙星的藥代動力學方面的報道，但還需要進一步研究。而研究恩諾沙星藥代動力學一個很重要的基礎是測定方法。水產(chǎn)品中恩諾沙星代謝主要通過血液、肝、腎等，最后主要滯留在肌肉、肝臟和腎臟中，目前恩諾沙星測定方法的報道主要集中在水產(chǎn)品的肌肉部分，而對血、肝、腎等組織的恩諾沙星測定方法缺少相關(guān)驗證及比較。本文旨在探索建立一套水產(chǎn)品血、肝、腎、肌肉中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星準確、簡便的測定方法。并應用該套測定方法初步研究了中華鱉中恩諾沙星的代謝規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters e2695高效液相色譜儀（2475熒光檢測器，美國Waters公司）；分散機（IKA T18）；氮吹儀（Organomation N-EVAP- 24）；旋渦混合器（VORTEX Wizard）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipor公司）。

1.2 色譜條件 色譜柱：Aglient TC-C18，5μm，4.6mm×250mm；流動相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（pH=2.4）∶乙腈=85∶15；柱溫：35℃；檢測波長：λex 280nm ， λem 450nm；流 速：0.8mL/min。

1.3 樣品處理

1.3.1 血清樣品 準確稱取2g血清樣品，加6mL磷酸緩沖液，漩渦混勻，過HLB固相萃取小柱（預先用3mL甲醇活化、5mL水洗）、5mL水洗柱，2mL流動相洗脫（藥物濃度高的血清樣用5mL流動相洗脫），過0.45μm濾膜，上機測定。

1.3.2 肝、腎、肌肉樣品 取1～5g肝、腎、肌肉樣品，加入15mL酸化乙腈，分散機勻漿1min，加2倍樣品質(zhì)量的無水硫酸鈉，漩渦提取，離心，取上清液。殘渣再用10mL酸化乙腈提取1次。合并上清液，35℃氮氣吹干。準確加入2.0mL流動相溶解，再分別用5mL正己烷凈化2～3次，下層溶液過0.45μm濾膜，上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線形范圍

2.2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分離與檢測

恩諾沙星和環(huán)丙沙星分離情況見圖1～3。如圖1所示，環(huán)丙沙星與恩諾沙星能很好的分離，基線平穩(wěn)，特異性強，重現(xiàn)性好。如圖2和圖3所示，樣品中恩諾沙星與環(huán)丙沙星和雜質(zhì)能很好的分離，得到較準確的實驗結(jié)果。

2.3 回收率和精密度 該方法條件下，血樣中恩諾沙星的回收率為89.7%～97.6%，RSD<7%，環(huán)丙沙星的回收率為87.6%～95.3%，RSD<7%。肝、腎、肌肉樣品中恩諾沙星的回收率為81.2%～94.2%，RSD<10%；環(huán)丙沙星的回收率為80.7%～89.5%，RSD<10%。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測限均為0.01μg/mL。

3 討論

3.1 血樣前處理 由于血樣基質(zhì)復雜，干擾物質(zhì)多，為了得到準確的實驗結(jié)果，尤其是低濃度樣品，對其凈化富集前處理技術(shù)就顯得尤為關(guān)鍵。目前文獻報道大多采用直接加甲醇等有機溶劑沉淀蛋白，離心后直接取上清液進樣的前處理方式[4，7-8]。但在實驗中發(fā)現(xiàn)該方法除雜效果不是非常理想，且上清液與流動相混合后可能產(chǎn)生沉淀。這些因素都有可能造成實驗結(jié)果的偏差。因此我們考慮采取固相萃取的手段來處理血樣[9]。通過實驗，發(fā)現(xiàn)HLB小柱能對血樣達到較好的進化濃縮的效果，且最后處理的樣品是以流動相為載體，減少了液相色譜上的溶劑效應。另外血清樣品粘度較高，過柱容易堵，流速比較難控制，因此實驗中用緩沖液稀釋血清樣后過柱，效果理想。

3.2 肝、腎、肌肉樣前處理 水產(chǎn)品組織肌肉中成分復雜，蛋白、脂類化合物含量較高，處理不好，極易干擾目標物的檢測。因此采用酸化乙腈提取，同時達到除蛋白的效果，然后用氮吹的方式濃縮，最后流動相溶解后用正己烷除脂肪凈化。期間還實驗了用固相萃取小柱進化的方式，除雜質(zhì)的效果比上述方法更好，但是需提取后轉(zhuǎn)溶劑再過柱，回收率有所損失。因此最終確定上述前處理方法。

應用所建立的方法，檢測了肌注給藥后恩諾沙星在中華鱉體內(nèi)的代謝規(guī)律，肌注后藥物吸收較快，2h內(nèi)血液中恩諾沙星的濃度很高，給藥后24h左右逐漸進入平臺期，此后消除緩慢，7d左右血液中的恩諾沙星殘留濃度<0.01 μg/g；在26d時肌肉中恩諾沙星的殘留濃度降至0.05mg/kg左右（圖4）。

參考文獻

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（責編：施婷婷）