高黎貢山土壤低溫淀粉酶產生菌的篩選

摘要：為獲取工業生產上有潛在應用價值的低溫淀粉酶產生菌，從高黎貢山百花嶺南齋公房采集的土樣中定向篩選得到10株產淀粉酶菌株，選擇其中透明圈有效值最大的GD-6菌株進行搖瓶發酵。結果表明，該菌株最適產酶溫度為20 ℃， 最佳產酶pH 為7.0，160 r/min搖瓶培養24 h后，產酶活性為420.9 IU/（mL·min）。

關鍵詞：高黎貢山；低溫淀粉酶產生菌；篩選；酶活性

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0784-03

Screening of Cold-Active Amylase-Producing Strain from Soil in Gongshan of Gaoli

YU Li，YAN Ai-fen

（Department of Resources and Environment， Baoshan University， Baoshan 678000， Yunnan，China）

Abstract： In order to obtain cold-active amylase-producing strain with potential value for industrial production， 10 amylase-producing strains were isolated from Southern Zhaigongfang of Gongshan in GaoLi. The strain， GD-6， which had effective value for maximum of transparent circle， was chose to ferment. The results showed that the optimal enzyme-producing condition of this strain was as follows： 20 ℃， pH 7.0， 160 r/min shake flask for 24 h. Under this optimal condition， the amylase activity was 420.9 IU/（mL·min）.

Key words： Gongshan of Gaoli； cold-active amylase-producing strain； screening； enzyme activity

淀粉酶是能催化淀粉水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一群酶的總稱[1]。低溫淀粉酶是一個相對的概念，其最適作用溫度比嗜溫淀粉酶要低20～30 ℃，而且在0 ℃有一定的酶活性。由于低溫淀粉酶具有在低溫下有效發揮催化作用的特點，使其在生物工程領域及解決現代能源危機中有著廣泛的應用前景[2]。有研究者從黃海、東海海底淤泥樣品中分離出低溫淀粉酶菌株Penicillum sp. FS010441，并對其進行了研究[3]。作者通過對高黎貢山高海拔地區土樣進行定向分離篩選研究，得到10株具有產淀粉酶能力菌株，對其中一株產酶能力較好的菌株進行了產酶條件的初步研究，以期篩選出工業生產上有潛在應用價值的低溫淀粉酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采自高黎貢山百花嶺南齋公房（海拔3 150 m）。

1.1.2 培養基 富集培養基。可溶性淀粉2 g/L，蛋白胨1 g/L，牛肉膏0.5 g/L，NH4NO3 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，KCl 0.5 g/L，自然pH。固體平板分離培養基。可溶性淀粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4 3 g/L，FeSO4·7H2O微量，MgSO4·7H2O 微量，瓊脂15 g/L，pH 7.0。該培養基不加瓊脂作為發酵培養基，分裝于250 mL三角瓶內，每瓶100 mL。

1.1.3 試劑 DNS試劑（二硝基水楊酸試劑）。用比色定糖法測定酶解液中還原糖的含量以測定酶活性。稱取酒石酸鈉22.75 g溶于125 mL水中，于溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.875 g，氫氧化鈉 5 g，加熱溶解，再加入重蒸酚0.625 g，無水亞硫酸鈉0.625 g，攪拌使之溶解，冷卻后定容至250 mL，放于棕色瓶中，放置7 d后使用[4]。500 μg/mL標準葡萄糖溶液。稱取105 ℃干燥2 h的分析純葡萄糖0.125 g，加水溶解，稀釋定容至250 mL。檸檬酸緩沖液。以0.1 mol/L的檸檬酸溶液和0.1 mol/L的檸檬酸三鈉溶液按比例混合，配制不同pH的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，用于1%淀粉溶液配制和酶活性測定。盧哥（Lugol）氏碘液。盧哥（Lugol）氏碘液按文獻[5]的方法配制。1%的淀粉溶液。1 g可溶性淀粉加入2.5 mL水溶解，再加35 mL沸水煮沸2 min，使其冷卻加入25%的檸檬酸鈉緩沖溶液至100 mL，作為酶活性測定的底物[6]。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產生菌的分離篩選方法 稱取土壤樣品10 g置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，劇烈振蕩10 min使樣品顆粒分散均勻。靜置5 min，取懸液10 mL置于裝有100 mL富集培養基的三角瓶中（3瓶重復）。37℃搖瓶培養3 d后，取培養液0.1 mL涂布培養于固體平板分離培養基中，37 ℃ 恒溫箱培養。菌體生長后，用盧哥氏碘液判斷是否有淀粉分解，通過測量透明圈大小，初步判斷水解淀粉的能力，挑取透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值較大的菌落進一步分離純化，將純化后的單菌落保存于營養瓊脂斜面培養基中。

1.2.2 菌株發酵條件確定和粗酶液的提取 將純化后的菌株活化后制成菌懸液，以2%接種量接入發酵培養基中，分別考查菌株在溫度5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下的產酶情況，160 r/min搖床培養24 h，以確定適宜的產酶發酵溫度和pH。發酵結束后直接用發酵液作為粗酶液用于酶活性測定。

1.2.3 DNS 法制作標準曲線 標準曲線的制作參考文獻[7]的方法，以葡萄糖作為標準溶液。

1.2.4 低溫淀粉酶活性的測定方法 取0.5 mL發酵液加入1 mL 1%的淀粉溶液使兩者充分混合后37 ℃水浴5 min，再把該混合液煮沸5 min，終止反應，再加入1 mL DNS，沸水浴5 min后迅速冷卻，加水2.5 mL，用723型分光光度計在波長620 nm 處測定吸光度。以發酵液加1%淀粉溶液直接煮沸再加DNS試劑反應作為空白對照[6]。

酶活性定義：在37 ℃，1 mL酶底物反應液1 min內產生相當于1 μg/mL葡萄糖的還原糖量規定為1個酶活性國際單位（1IU）。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選結果

利用篩選培養基從土壤樣品中初步分離獲得產淀粉酶的菌株10株，初步篩選出D/d大于2的6株產淀粉酶能力較強的菌株（表1）。由表1可見，GD-6菌株的D/d最大，其次是GD-3、GD-4菌株，D/d大表明該菌株產生的淀粉酶分解淀粉能力強，由此初步確定GD-6菌株產淀粉酶能力最強。故以該菌株為試驗菌株進行產酶條件及酶活性研究。

2.2 葡萄糖標準曲線的繪制結果

用不同葡萄糖濃度與DNS共熱反應顯色后，測出其在620 nm處的吸光度，作出標準曲線（圖1）。得出回歸方程■=1.531 3x-0.327 5，用于酶活性的測定。

根據標準曲線和計算公式得：還原糖量（μg/mL）=[（OD620 nm+0.307 5）/1.151 3]×1 000，則酶活性=還原糖濃度/[作用時間（5 min）×粗酶液（0.5 mL）]

2.3 最適產酶溫度的確定結果

利用GD-6菌株分別在10、15、20、25、30、35、 40 ℃下，pH 7.0，160 r/min搖瓶發酵培養24 h后，以發酵液作為粗酶液進行低溫淀粉酶活性測定，然后在波長620nm處進行吸光度測定并計算酶活性。反應溫度對酶活性的影響見圖2。由圖2可知， GD-6菌株最適產酶溫度為20 ℃，在20 ℃條件下培養產酶活性可達420.9 IU/（mL·min），產酶能力最強。

2.4 最適產酶pH的確定

在酶活性測定反應體系中，在最適作用溫度（20 ℃）下，利用GD-6分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下進行發酵培養，以發酵液作為粗酶液進行酶活性測定，在波長620 nm處進行吸光度測定并計算酶活性。pH對酶活性的影響見圖3。由圖3可知，GD-6菌株所產淀粉酶的活性在20 ℃、pH 7.0的培養條件下最高，為420.6 IU/（mL·min）。

3 結論

高黎貢山百花嶺南齋公房海拔3 150 m，年平均氣溫在15 ℃左右，最低氣溫為達-6 ℃，屬高海拔高寒地區，有利于低溫微生物的生長。通過對該地區土樣的研究，得到了6株產淀粉酶能力較強的菌株，編號為GD-1、GD-2、GD-3、GD-4、GD-5、GD-6；通過比較透明圈有效值的大小初步判斷產酶活性，選取GD-6為研究菌株進行低溫下產淀粉酶能力的研究。最終確定GD-6菌株最適產酶溫度為20 ℃，最適產酶pH 7.0，160 r/min搖瓶培養24 h后，酶活性可達420.9 IU/（mL·min）。

參考文獻：

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