射干地龍顆粒對雞的亞慢性毒性試驗

摘要：為研究射干地龍顆粒的安全性，將120只21日齡的三黃肉雞，隨機分為3倍劑量組、6倍劑量組、12倍劑量組和對照組，觀察射干地龍顆粒對雞的心、肝、脾、肺、腎臟和血液等組織的影響。結果表明，各組雞的體重、臟器指數以及血常規指標組間差異總體不顯著（P>0.05），血清丙氨酸氨基轉移酶活性及肌酐含量與藥物劑量間呈現無規律性變化，白蛋白含量和尿素含量與對照組差異不顯著（P>0.05）。在用藥后，各組雞的心、肝、脾、肺和腎臟均無明顯差異，表現正常。

關鍵詞：射干地龍顆粒；雞；亞慢性毒性；生理生化指標

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0878-05

Study on Subchronic Toxicity of Shegan Dilong Particles in Chicken

WANG Gui-bo1，WANG Dong-sheng1，XIE Jia-sheng1，ZHENG Ji-fang1，LUO Chao-ying1，LI Jin-yu1，

LUO Yong-jiang2，XIN Rui-hua2，LI Xiao-rong3

（1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050，China；

2.Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development， Ministry of Agriculture，Lanzhou 730050，China；

3.Institute of Livestock Grass and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）

Abstract： In order to evaluate the safety of Shegan Dilong particles， 120 21-day-old Sanhuang broilers were randomly divided into four groups including the 3-fold dose group， 6-fold dose group， 12-fold dose group and the control group. The impact on the chicken’s heart， liver， spleen， lung， kidney and blood were observed. The results showed that the difference of overall weight， organ index and blood indicators in each group of chicken was not significant（P>0.05）， while there was no regularity between the serum alanine aminotransferase activity， creatinine concentration and drug dosage of each group while the content of albumin and urea had no significant differences compared with the control group（P>0.05）. After administration， the performance of chicken’s heart， liver， spleen， lung and kidney were not significantly different from normal in all groups. Key words： Shegan Dilong particles； chicken； subchronic toxicity； physiological and biochemical indexes

隨著雞群養殖的集約化程度越來越高，雞呼吸道疾病成為當前養雞業中具有嚴重危害的一類疾病，造成了巨大的經濟損失，而且還影響了相關產品的品質。目前雞呼吸道疾病的治療多采用疫苗緊急免疫或者西藥治療，而疫苗免疫具有免疫失敗的潛在危險性，西藥治療又極易產生細菌耐藥性。中藥治療則避免了此類問題的發生，又符合當前人們對畜產品安全性的需求。

射干地龍顆粒是純中藥制劑，具有調節免疫力、解熱鎮痛、抑制病毒復制、抗菌消炎和高效低毒等功效。根據新獸藥報批的要求，研究射干地龍顆粒對雞的亞慢性毒性，即對受試雞長期喂飼不同劑量的藥物，可以了解藥物對雞的毒性作用、確定藥物的最大無作用劑量，了解藥物是否具有致畸作用和致癌作用，對藥物的安全性作出客觀評價，并為其臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用藥 射干地龍顆粒由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，主要由射干、地龍、北豆根、甘草等中藥成分組成。

1.1.2 儀器及試劑 邁瑞BS-420型全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；AUW120D電子天平購自日本島津公司；LEICA RM2025型組織切片機、LEICA TP1020型組織脫水機購自德國Leica公司；CK-2型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；CELL-DYN3200血細胞分析儀購自美國雅培公司；天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒（批號：0030）、丙氨酸氨基轉移酶試劑盒（批號：0061）、白蛋白試劑盒（批號：140909027）、肌酐試劑盒（批號：0037）和尿素試劑盒（批號：0051）均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.1.3 試驗動物 三黃肉雞購自蘭州市西固區華隴雞場，在中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所標準化實驗動物房適應性飼喂一周。將雞隨機分為4組（每組30只）：3倍劑量組、6倍劑量組、12倍劑量組和對照組。

1.2 試驗方法

1.2.1 給藥方案 根據試驗雞21日齡時的平均體重，對3倍劑量組、6倍劑量組和12倍劑量組分別按照正常治療劑量（500 mg/kg）的3倍、6倍和12倍量將藥物均勻混入飼料進行飼喂，要求當日必須凈槽，連續飼喂兩周。14 d后再次稱取雞只體量，按照以上給藥方案重新計算給藥量，拌料飼喂兩周。對照組不給予任何藥物，進行正常飼喂。

1.2.2 體重和臟器指數觀察測定 每天觀察各組雞的健康狀況，包括活動、采食、飲水、發病和死亡等。第14天時各組雞隨機選取10只稱重，然后心臟采血和剖檢。第28天時各組剩余雞再隨機選取10只重復上述操作。剖檢觀察雞的實質性臟器有無眼觀病理變化，對心、肝、脾、肺、腎稱重并計算臟器指數（臟器濕重/體重×100%）。組織切片取材，4%甲醛固定48 h后做組織切片，經HE染色后進行顯微鏡觀察。

1.2.3 血常規指標測定 用CELL-DYN3200血細胞分析儀進行血常規分析，主要測定白細胞（WBC）數、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比、中性粒細胞百分比、紅細胞（RBC）數、血紅蛋白（HGB）含量、血小板（PLT）數。用邁瑞BS-420型全自動生化分析儀測定血清中肌酐含量、尿素含量、白蛋白（Albumin，ALB）含量、天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransterase，AST）和丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）活性。

1.2.4 數據統計 所有數據均用x±s表示，用SPSS 14.0軟件進行方差分析。P<0.05時表示差異顯著；P<0.01時表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 射干地龍顆粒對雞體重的影響

在給藥0、14、28 d后，各給藥組雞的平均體重與對照組相比顯著不差異（P>0.05）（表1），結果表明射干地龍顆粒對雞體重增長無明顯影響。

2.2 射干地龍顆粒對雞臟器指數的影響

在連續給藥14 d和28 d后，各給藥組雞的臟器指數與對照組均無顯著差異（P>0.05）（表2），結果表明射干地龍顆粒對雞臟器無明顯影響。

2.3 射干地龍顆粒對雞血常規指標的影響

連續用藥14 d后3倍劑量組雞的淋巴細胞百分比顯著高于對照組（P<0.05）；3倍劑量組和6倍劑量組雞的單核細胞比例顯著低于對照組（P<0.05）；而紅細胞數量、白細胞數量、血紅蛋白含量、血小板數量和中性粒細胞比例組間差異不顯著（P>0.05）（表3）。

連續用藥28 d后各給藥組指標變化僅12倍劑量組中性粒細胞比例顯著低于對照組（P<0.05）；而各給藥組雞其他所測血常規指標組間均差異不顯著（P>0.05）（表4）。

2.4 射干地龍顆粒對雞生化指標的影響

連續給藥14 d后各組雞的血清ALT活性與對照組相比，3倍劑量組呈現顯著下降（P<0.05），12倍劑量組則極顯著下降（P<0.01），而6倍劑量組則表現差異不顯著（P>0.05），血清ALT活性與藥物劑量間呈現無規律性變化；而各組雞的血清AST活性和白蛋白含量各組間差異不顯著（P>0.05），結果表明，連續給藥射干地龍顆粒14 d后對AST活性和白蛋白含量影響較小。連續用藥14 d后各組雞的血清肌酐含量與對照組相比，3倍劑量組顯著下降（P<0.05），而與6倍劑量組和12倍劑量組均顯著不差異（P>0.05）；對照組雞的尿素含量與其他各給藥組間均差異不顯著（P>0.05）（表5）。

連續用藥28 d后各組雞與對照組相比，ALT活性僅6倍劑量組顯著降低（P<0.05）；而各組雞AST活性在用藥28 d后，僅12倍劑量組與對照組差異不顯著（P>0.05），3倍劑量組和6倍劑量組極顯著低于對照組（P<0.01）；各組間血清白蛋白含量均差異不顯著（P>0.05）。與對照組相比，連續用藥28 d后各給藥組雞的血清肌酐含量，僅3倍劑量組差異顯著（P<0.05），而血清尿素含量各給藥組間均差異不顯著（P>0.05）（表6）。

2.5 雞臟器剖檢結果

連續用藥14 d和28 d后，各給藥組雞的心、肺、脾和腎臟均未出現明顯的異常。心臟在質地方面均沒有明顯的眼觀異常，心臟為圓錐體、顏色粉紅，心包膜及心包液透明，閏盤結構完整，心肌纖維致密和肌纖維束分布均勻，細胞核和胞漿均勻。肺臟在質地方面也均沒有明顯的眼觀異常，肺扁平呈長四邊形海綿狀，顏色粉紅，有結構完整、分布均勻、大小不等的肺泡。脾臟在質地方面沒有明顯的眼觀異常，如球體，顏色棕紅，脾束、脾血竇和小靜脈結構明顯，淋巴細胞均勻分布，皮質、髓質結構完整。腎臟在質地方面均無明顯的眼觀異常，腎臟為紅褐色，呈長條狀，質軟，腎小體、近曲小管和遠曲小管結構完整，腎小管密集，細胞核大小一致，分布均勻。肝臟在質地方面沒有明顯的眼觀異常，呈紅褐色，肝組織以肝細胞及中央靜脈為中心，呈放射狀排列，肝細胞呈梁索狀。

3 小結與討論

3.1 射干地龍顆粒的作用機制

射干地龍顆粒以射干和地龍為主藥。在傳統的射干麻黃湯的基礎上加味，集射干的開結消痰和地龍的平喘定哮及化痰鎮咳的作用于一體。組方中其他藥味具有降逆化飲、散寒行水、溫潤除痰、下氣止咳和益脾養胃等功效。各藥配伍使用可起到宣肺散寒、化飲止咳的功效，適用于雞咳喘性呼吸道病的治療。異黃酮類化合物是射干的主要提取物，可發揮抗炎鎮痛的作用，其作用機制主要是抑制受到脂多糖的誘導的氧化亞氮和前列腺素E2的生成，從而發揮作用而成為抗炎的先導化合物[1]。射干的提取物還能夠抑制血栓素A2的合成和促進前列環素的合成而發揮祛痰平喘的藥理效應。研究表明射干可以顯著提高免疫力而抑制小鼠血清中IgM的含量，從而證明射干可以增強小鼠的體液免疫[2]。地龍中含有的琥珀酸能夠阻滯組胺受體，從而起到緩解氣管痙攣和使毛細血管通透性增加的作用[3]；陳隨清等[4]研究表明地龍可以對侵害肺部感染的常見病菌起到抑制作用。射干地龍顆粒具有抗炎鎮痛、緩解支氣管平滑肌痙攣、提高機體免疫力和促進炎癥物質吸收等作用，適合作為治療雞傳染性呼吸道病的復方制劑。

3.2 射干地龍顆粒對雞體重和臟器指數的影響

體重和臟器指數可以反映藥物對動物的影響，并作為衡量藥物毒性的重要指標。其值的升高或降低可以不同程度地反映機體對藥物的敏感性及臟器的充血、水腫、增生或萎縮、退變等情況。該研究表明在連續用藥14、28 d后各組雞體重與對照組相比均無顯著差異（P>0.05），故射干地龍顆粒對雞體重和臟器指數影響較小。

3.3 射干地龍顆粒對雞血常規指標的影響

藥物對機體的血液毒性常通過血常規指標來說明。紅細胞、血紅蛋白、白細胞與血小板數量在連續用藥14、28 d后組間均差異不顯著（P>0.05）。雖然雞的紅細胞為有核細胞，但由于應用了ELL-DYN3200血細胞分析儀進行血細胞計數，通過特殊的新美藍試劑染色后再將標本進行分析，從而確保了紅細胞計數數值的準確性；應用激光法對血小板進行檢測，使血小板和血細胞能夠得到精確的區分[5]。在連續用藥14 d時低劑量組的淋巴細胞數顯著高于對照組（P<0.05），藥物是通過活化淋巴細胞而起到提高機體免疫力的作用，其主要原因可能是地龍肽提高了淋巴細胞的增殖率[6]。中低劑量組的單核細胞比例顯著低于對照組（P<0.05），而高劑量的藥物對淋巴細胞比例的影響與對照組差異不顯著（P>0.05），因此結合淋巴細胞比例升高的結果并不能說明藥物對單核細胞比例造成了顯著影響。連續用藥28 d時高劑量組的中性粒細胞比例顯著低于對照組（P<0.05），同時中低劑量組與對照組相比也呈現下降趨勢，結果與趙紅等[7]報道在射干麻黃湯對患有氣道炎癥的哮喘大鼠的中性粒細胞減少的趨勢相一致。

3.4 射干地龍顆粒對肝腎功能指標的影響

多數藥物在體內經過肝臟轉化的過程中，都會對肝臟造成損害，且損傷的程度與藥物劑量和濃度等有關。而肝臟的損傷就會導致ALT和AST活性及白蛋白含量的升高，因此常用ALT和AST活性并結合白蛋白含量來說明藥物對動物肝細胞的損傷程度。該研究中各給藥組雞血清ALT活性與藥物劑量間呈無規則變化，且低于對照組，不具有臨床意義。6倍劑量組和3倍劑量組的血清AST活性雖在用藥28 d后比對照組顯著降低（P<0.05），但結合白蛋白含量與對照組間差異不顯著（P>0.05）及ALT活性的結果，并不能說明6倍劑量和3倍劑量的藥物會對雞的肝細胞造成損傷。研究表明在肝臟受損傷的同時前列腺素（Prostaglandin，PG）的含量會降低，而PG通過作用于甾體類激素影響特異蛋白的合成。AST活性的降低可能與藥物組方中甘草的主要成分甘草甜素可以調節PG的合成速度，使甾體類激素通過肝細胞核上的受體減弱了AST特異基因的表達，從而影響了酶蛋白合成[8-10]。一些藥物的原形及代謝產物從腎臟排泄過程中也會損害腎臟[11]。該研究中血清肌酐含量與藥物濃度間呈無規律變化，結合尿素含量組間差異不顯著（P>0.05）的結果，表明在試驗劑量范圍內該藥物對腎功能的影響較小。

3.5 射干地龍顆粒對雞臟器病理變化的影響

在用藥14、28 d后各給藥組雞的心、脾、肺和腎臟在顏色質地方面沒有明顯的眼觀異常，除對照組一只雞出現肝周炎、12倍劑量組一只雞肝臟出現壞死斑點外其余雞的肝臟在顏色質地方面均表現正常。經HE染色后，顯微鏡下觀察，各組雞的心、肝、脾、肺和腎臟均無明顯差異，表現正常。表明射干地龍顆粒對雞臟器病理變化的影響較小。

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