混菌固態發酵產纖維素濾紙酶條件的研究

摘要：以稻草粉和麩皮為主要原料，利用擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）和黑曲霉（Aspergillus niger）（1∶1）混菌固態發酵產纖維素濾紙酶。以初始pH、發酵時間、發酵溫度、接種量、裝樣量、含水量為研究因子，通過對擬康氏木霉和黑曲霉（1∶1）混菌固態發酵產纖維素濾紙酶的最佳發酵條件進行優化，優化后的最佳產酶條件為：固體培養基含水量為50%，初始pH 5.0，裝樣量15 g/500 mL，接種量為8%，30 ℃恒溫培養5 d。

關鍵詞：固態發酵；纖維素濾紙酶（FPA）；擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）；黑曲霉（Aspergillus niger）

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0889-03

Cellulase-Producing Conditions by Solid-State Fermentation of Mixed Strains

HUANG Fang-Yi，KE Xia

（Department of Biotechnology， Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415， China）

Abstract： Cellulase were produced by solid-state fermentation taking straw and wheat bran as the main raw materials by mixed strains Trichoderma pseudokoningii and Aspergillus niger with the ratio of 1∶1. The fermentation conditions such as the initial pH， fermentation time， cultivation temperature， inoculation dose， medium dose and water content were aptimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimized producing conditions of cellulose were， water content in medium， 50%； initial pH 5.0； medium dose， 15 g/500 mL； inoculation dose 8%； culture temperature， 30 ℃； fermenting for 5 d.

Key words： solid-state fermentation； cellulase； Trichoderma pseudokoningii； Aspergillus niger

纖維素是一切植物的主要成分，是地球上最豐富最廉價的可再生資源。如何提高富含纖維素的工農業廢棄物的利用率已成為近年來研究的熱點[1-3]。目前，中國纖維素濾紙酶生產主要是利用純種進行單菌固態或液態發酵，而混菌發酵可相互補充，促進纖維素類物質的分解，近年來混合菌的作用逐漸受到重視。涂璇等[4]、胡奎娟等[5]、鄒水洋等[6]、王志等[7]、蘇香萍等[8]先后對混菌發酵產酶進行了研究。該研究以纖維素濾紙酶活（FPA）為指標，探討了擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）和黑曲霉（Aspergillus niger）混菌固態發酵產纖維素濾紙酶過程中培養條件對產酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）購于ACCC（中國農業微生物菌種保藏管理中心），菌株編號30940；黑曲霉（Aspergillus niger）保存于武漢生物工程學院發酵工程實驗室。

1.1.2 培養基 斜面培養基：PDA培養基；固體發酵培養基：稻草70 g、麩皮30 g、Mandels營養液[（NH4）2SO4 2.5 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，NaNO3 0.2 g，FeCl3 0.02 g，1 000 mL水，pH 5.0]100 mL。混勻后121 ℃、30 min滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 稻草預處理 稻草烘干，剪至3 cm左右，經烘干粉碎過 80目篩備用。

1.2.2 培養方法 將在斜面上培養3 d的擬康氏木霉菌株和黑曲霉菌株分別稀釋成1.0×107個/mL的孢子懸浮液，分別取1 mL接于100 mL液體種子培養基中，于28 ℃、160 r/min培養3 d，將液體種子按10%的接種量（兩菌接種比例為1∶1）接種于固體發酵培養基中，攪拌均勻，于28 ℃恒溫培養4 d。

1.2.3 粗酶液的制備 將固體發酵物加入適量的檸檬酸緩沖液，攪拌均勻，180 r/min搖床振蕩浸提30 min，然后在4 000 r/min離心20 min，用濾布過濾，取上清液即為粗酶液，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 酶活測定方法 總酶活（FPA酶活）單位：1 g固體酶，在50 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘水解濾紙底物，產出相當于1 μmol葡萄糖的還原糖量，為1個酶活力單位，以I U/g表示[9]。

2 結果與分析

2.1 初始pH對FPA的酶活的影響

調節Mandels營養液pH，在不同初始pH的固體培養基中發酵4 d，測FPA酶活。由圖1可知，當起始pH為 4.0～6.0時，酶活較高，其中，當pH為5.0時，FPA酶活最高（218.45 IU/g），與鄺哲師等[10]研究里氏木霉固態發酵結果相似，隨著pH的繼續上升，酶活呈明顯下降趨勢。

2.2 溫度對FPA酶活的影響

在500 mL錐形瓶中裝入10 g固體培養基和10 mL Mandels營養液分別在不同溫度下培養4 d，測定酶活，溫度對FPA酶活的影響見圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，酶活先逐漸上升，在30 ℃時酶活達到最高（242.50 IU/g），在30～32 ℃時，溫度對酶活影響不顯著，但當溫度繼續升高時，FPA酶活呈明顯下降趨勢。

2.3 裝樣量對FPA酶活的影響

裝樣量的多少直接影響發酵過程中的通氣量，裝樣量過高或過低都會影響酶活[11]。向500 mL錐形瓶中分別裝入不同量的固體培養基，不同裝樣量對酶活的影響見圖3。由圖3可知，當裝樣量10～20 g/500 mL時，對產酶影響較小，15 g/500 mL時酶活達到最高（253.90 IU/g），裝樣量低于10 g/500 mL時，不利于菌體均勻生長，營養不充分；裝樣量高于20 g/500 mL時，則易造成菌體缺氧，且生長溫度升高不利于混合菌代謝產酶。

2.4 接種量對FPA酶活的影響

接種量直接影響產酶結果，接種量過少，菌種生長達到穩定期的時間較長；接種量過多，會導致營養物質供應不足[12]。按固體培養基的質量百分比不同接入擬康氏木霉和黑曲霉菌株，接種量對酶活的影響見圖4。由圖4可知，接種量在4%～8%時，酶活呈上升趨勢，在接種量8%時，酶活達到最高（263.40 IU/g），之后隨著接種量的繼續增加，酶活反而降低。

2.5 含水量對FPA酶活的影響

選擇合適的水分比例，在固態發酵中顯得尤為重要。由于固態發酵時好氧發酵，水分過多，會影響透氣性，使培養基內部散熱困難，且易造成雜菌污染。水分過少，則可能滿足不了菌絲生長的需要，造成產酶活力低下[13]。由圖5可知，當培養基的含水量為50%時，PFA酶活達到最高（304.0 IU/g），當含水量達55%以上時，隨著水量增加，酶活明顯下降。

2.6 培養時間對FPA酶活的影響

真菌生長代謝大致可分為兩個階段，前期以孢子萌發、菌絲細胞生長為主，后期（菌絲發育到一定程度）則以產酶為主，產酶活力最高為發酵成熟標志[14]。發酵按上述優化條件，從第二天開始，每天測FPA酶活，結果見圖6。第二至五天時，FPA酶活呈上升趨勢，尤其是第三至四天上升趨勢明顯，第五天達到最高（346.30 IU/g），第四至六天酶活變化不明顯，第五天之后酶活逐漸降低，可能是由于菌絲老化而降低了產酶量[15]。

2.7 對照試驗結果

采用以上優化條件進行混菌培養，以擬康氏木霉和黑曲霉分別單菌培養為參照（見圖7）。結果表明，混菌固態發酵產FPA酶活較單菌發酵有大幅度提高。

3 小結與討論

以稻草粉和麩皮為主要原料，研究了初始pH、溫度、裝樣量、接種量、含水量、發酵時間等條件對擬康氏木霉和黑曲霉（1∶1）混菌固態發酵產FPA酶活的影響。優化后的產酶條件為：固體培養基含水量為50%，初始pH 5.0，裝樣量15 g/500 mL，混合接種量為8%，30 ℃恒溫培養5 d。

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