吡格列酮對家兔局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響

[摘要] 目的 探討吡格列酮對腦缺血再灌注損傷家兔細胞凋亡的影響及其機制。 方法 40只雄性家兔隨機分為5組：①假手術組（S組，n = 8）；②模型組（M組，n = 8）；③吡格列酮組（P組，n = 8）；④GW9662+吡格列酮組（GP組，n = 8）；⑤DMSO組（D組，n = 8）。除S組外，其余各組均通過線栓法建立家兔大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注損傷模型。于術前30 min分別給予相應處理。缺血120 min再灌注24 h后，對家兔進行神經功能評分；HE染色觀察病理形態學，TUNEL檢測神經細胞凋亡。 結果 ①與S組比較，M組神經功能評分明顯增加（P < 0.05）；與M組比較，P組神經功能評分明顯降低（P < 0.05）。②與S組比較，M組凋亡細胞明顯增加（P < 0.05）；與M組比較，P組凋亡細胞明顯降低（P < 0.05）。 結論 吡格列酮可通過減輕形態學改變、抗神經細胞凋亡，對神經細胞發揮保護作用。

[關鍵詞] 吡格列酮；GW9662；腦缺血/再灌注；細胞凋亡

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）04-0001-03

近年研究表明，PPARγ表達的升高對于腦缺血再灌注損傷具有一定的神經保護作用[1]，已成為腦血管病研究領域中的熱點課題。作為PPARγ的激活配體——吡格列酮（pioglitazone，PGZ）臨床上廣泛應用于治療2型糖尿病，但有研究表明其對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經保護作用[2]，而具體機制尚未完全闡明。本實驗采用家兔局灶性腦缺血再灌注模型，應用PGZ進行預處理，觀察其對家兔術后神經功能及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組

清潔級雄性家兔40只，重量750～1 000 g。術前12 h禁食不禁水，隨機分為5組，每組8只：①假手術組（S組）；②模型組（M組）；③吡格列酮組（P組）；④GW9662+吡格列酮組（GP組）；⑤DMSO組（D組）。

1.2 試劑

吡格列酮、GW9662和10%二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國）；原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；電子顯微鏡（Olympus，日本）等。

1.3 動物模型制備及處置

M組：術前20 min經耳緣靜脈注射生理鹽水2 mL/kg，采用改良的Zea-longa[3]法制備家兔大腦中動脈阻斷（MCAO）模型。缺血120 min后抽出線栓即可造成再灌注模型。模型成功標志：蘇醒后出現左側Horner綜合征；爬行時向右側轉圈或跌倒。P組：術前20 min經耳緣靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。GP組：術前20 min先經耳緣靜脈注射GW9662，劑量是0.3 mg/kg[4]，5 min后再經耳緣靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。D組：術前20 min經耳緣靜脈注射10% DMSO 2 mL/kg。S組：術中分離左側CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血處理。

1.4 指標檢測

1.4.1 神經功能評分 再灌注24 h后采用雙盲法按Zea-longa 5分法進行神經功能評分，標準如下：①無神經功能缺失癥狀，計0分；②不能伸展右側前肢，計1分；③爬行時向右側轉圈，計2分；④身體向右側傾倒，計3分；⑤不能自發爬行、意識障礙，計4分。

1.4.2 HE染色 將各組8只家兔麻醉，以生理鹽水進行心臟灌洗，用4℃ 10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速斷頭取腦。距額葉前端3 mm和9 mm處進行冠狀分離，取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側約2 mm處，從上至下切去兩側半球的正中結構，將左側腦塊作為缺血腦組織，制成蠟塊。自前往后連續冠狀位切片，厚約5 μm。HE染色光學顯微鏡下（400×）觀察神經細胞形態學變化并采圖。

1.4.3 TUNEL染色 嚴格按照試劑盒檢測步驟進行操作。TUNEL染色在光鏡下（400×）觀察凋亡細胞（以胞核出現棕黃染色顆粒代表），計算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細胞數占總細胞數的比值并采圖。

1.5 統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。神經功能評分中位數/四分位數法表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況及神經功能改變

S組家兔對外界反應靈敏，其余4組家兔對外界反應靈敏度不同程度降低，其中以M組最遲鈍，P組最佳。5組家兔神經功能評分比較見表1。

2.2 HE染色的比較

切片經HE染色后，光鏡下可見S組神經細胞形態正常，胞質色淡且均勻，核大而圓，核仁明顯（圖1A）。M組呈明顯的缺血損傷性改變，多數細胞體積縮小，胞漿疏松，胞核固縮深染，部分細胞壞死（圖1B）。經吡格列酮預處理的P組缺血性損傷改變較M組明顯減輕，壞死區域縮小（圖1C），而GP與D組較M組的缺血改變則無明顯減輕，可見神經細胞正常結構消失，部分細胞出現壞死（圖1D和圖1E）。

2.3 TUNEL染色的比較

S組只有少量凋亡細胞（圖2A），與其余4組大鼠相比差異均有統計學意義（P < 0.01）。M組凋亡細胞陽性率為（63.06±9.05%，圖2B），而經吡格列酮預處理的P組相應區域凋亡細胞陽性率（48.10±7.61%，圖2C），兩組相比差異也有統計學意義（P < 0.01），而GP與D組較M組的細胞凋亡率則無明顯改變。5組大鼠腦組織中凋亡細胞率比較見表1。

3 討論

既往研究表明，腦缺血再灌注時神經細胞可介導大量炎性細胞的聚集和炎性因子的釋放[5]，造成神經元凋亡，從而造成對缺血損傷區域細胞的損傷。本研究也發現模型組中細胞凋亡數量相比假手術組顯著升高。有研究發現，PPARγ激動劑能活化細胞外信號調節激酶而抑制NF-κB的激活[6]。NF-κB可調控表達許多參與炎癥反應、氧化損傷、免疫反應和細胞凋亡等過程的蛋白基因。持續活化在垂死神經元中的NF-κB可誘導細胞凋亡，包括重新進入細胞循環失敗和生成死亡蛋白[7]；炎癥反應過程中釋放一系列細胞因子信號降解IκB的激酶（IKK）活化并磷酸化IκB的兩個Ser殘基，釋放出與IκB相結合的NF-κB并轉移到細胞核而使目的基因的表達增加，從而產生大量的炎癥介質參與病理生理過程[8，9]。

吡格列酮作為PPARγ特異性激動劑，目前在臨床主要用于治療2型糖尿病。國內有研究報道，吡格列酮促進PPARγ mRNA和蛋白的表達，增強其對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用，并且與劑量成正比[10]。本實驗發現經吡格列酮預處理后的家兔神經功能缺損較模型組明顯改善，缺血半暗帶的頂葉皮質中細胞凋亡數量明顯減少。由此我們認為吡格列酮可通過減少細胞凋亡而達到神經保護的作用；若事先靜脈注射GW9662[11]后再給予吡格列酮，則可逆轉吡格列酮的上述保護作用；同樣，單獨行DMSO預處理后的大鼠在相關方面未得到明顯的改善。

除此之外，從腦組織病理形態學比較來看，模型組家兔腦組織變性壞死的細胞明顯高于其余四組且主要分布于缺血半暗帶的頂葉皮質，主要表現為神經細胞壞死，表明再灌注后缺血半暗帶發生了明顯的細胞變性壞死反應，符合缺血缺氧性病理變化；而經吡格列酮預處理組家兔腦組織則以神經細胞腫脹為主，表明吡格列酮具有抗細胞壞死作用，在一定程度上挽救了受損的神經細胞，對缺血再灌注腦損傷起到一定的保護作用；而預先給予GW9662后再行吡格列酮預處理及單獨行DMSO預處理的家兔腦組織病理形態學方面均無明顯改善，提示吡格列酮具有阻止或延緩神經細胞壞死，對保護缺血再灌注后神經細胞損傷具有積極意義，而GW9662則可逆轉吡格列酮抗細胞壞死的效應。

由此可見，吡格列酮可通過減輕家兔缺血再灌注后的損傷，從而很好地減少細胞凋亡，為該藥在缺血性腦血管疾病的臨床使用提供一定的理論依據。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012-11-05）