雜種黃秋葵莖尖及試管苗培養的研究

摘 要：采用莖尖和試管苗培養的方法，以黃秋葵生長點為材料，進行了生長點的生長、分化芽的生根和試管苗的生根繼代增殖培養，以及試管苗的移栽與定植的研究。結果表明：1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是生長點伸長生長的理想培養基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是生長芽分化培養的理想培養基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是分化芽生根培養和生根繼代增殖培養的理想培養基。試管苗移栽成活率為94.7%；定植成活率為97.4%；定植的試管苗保持了雜種黃秋葵的雜種優勢。

關鍵詞：黃秋葵；組織培養；試管苗

中圖分類號：Ｓ６４１ 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.02.00４

Study on Propagation for Tender Buds and Tube Seedlings of Abelmoschus esculentus

XIA Hong-fei， LIU Lin-lin， LI Hui， WANG Xiao-xu， JIANG Chang-yang

（College of Life Sciences， Liaoning Normal University， Dalian， Liaoning 116029， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using the culture methods of shoot tip and tube seedlings， the Abelmoschus esculentus growing point for the material， the study was mainly on growth of growing points， differentiation of differentiation bud， rooting and subculturing of tube seedlings， and tube seedlings transplanting colonization. The results demonstrated that： 1/2MS + ZT 0.2 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 was the optimum medium for the elongation growth of growing points； MS+6-BA 0.7 mg·L-1 + AgNO30. 8 mg·L-1 + NAA0.1 mg·L-1 was the suitable medium for differentiation cultivation of growth bud； 1/3MS + ABT 0.6 mg·L-1 + sucrose 10 g·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1 was the optimum medium for differentiation， rooting and subculture of differentiation bud. The transplanting survival rate of tube seedlings was 94.7% and stable planting survival rate was 97.4%. Colonization of plantlets maintained the heterosis of Abelmoschus esculentus.

Key words： Abelmoschus esculentus； ｔissue culture； ｔube seedlings

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）又稱秋葵、補腎菜、阿華田、羊角豆等，屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物[1-2]。黃秋葵全株含黃酮和多種微量元素等有效成分，具有抗疲勞、提高免疫力和抗癌等功效，能治皮膚癌、燒傷、燙傷、胃炎和胃潰瘍等疾病[3-4]。近年來果實的食用研究發現，黃秋葵的嫩果作為蔬菜食用，具有非常明顯的補腎壯陽作用，由此引起人們的高度重視。

黃秋葵是異花授粉植物，偶爾會在實生苗植株中出現1株生長旺盛、結果多、具有明顯雜種優勢（以下簡稱雜種黃秋葵）的植株。但是，由于黃秋葵只能通過種子進行繁殖，因此無法使雜種黃秋葵的種質得到保存。為滿足人們栽培的需要，使雜種黃秋葵的種質得到保存，2010年7月，再次發現雜種黃秋葵植株時，對其進行了生長點和試管苗培養的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 材料培養及滅菌 7月中旬，將在大連郊區發現的雜種黃秋葵的植株頂端剪掉，采用頂端優勢的措施，促進分枝，增加生長點的數量。待8月上旬生長出6個分支，并形成多個生長點后，將分枝采回實驗室，除掉葉片后，將具有生長點的嫩莖放到廣口瓶中，用無菌水洗滌3次后，再用0.01%的安利洗滌液洗滌5 min左右，接著用蒸餾水漂洗2次。轉移到超凈工作臺上，用70%的乙醇滅菌10 s左右，立刻用無菌水洗滌3次，再用0.05%的HgCl3溶液振蕩滅菌10 min，接著用無菌水振蕩洗滌6次，即可獲得具有生長點的嫩莖。

1.1.2 培養條件 以附加不同濃度、不同種類的細胞分裂素、生長素的MS或1/3MS為培養基。以MS為基本培養基附加蔗糖30 g·L-1，以1/3MS為基本培養基附加蔗糖10 g·L-1。培養基的pH值為6.0。培養過程在暗培養和光照培養兩種條件下進行。光培養的光照度3 000 lx，12 h·d－１，培養溫度為25 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 生長點的伸長生長培養 在超凈工作臺上，將無菌嫩莖切成邊長0.5 cm左右、具有1個生長點的莖段（下稱莖段），接種到附加不同濃度的IBA、NAA或IAA的1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1的培養基上，進行生長點伸長生長培養試驗。試驗重復2次，每個培養基接種10個具有生長點的莖段。

1.2.2 生長芽分化培養 把由生長點培養的生長芽剪成長約0.8 cm、具有2個生長點的莖段后，接種到以MS+6-BA 0.7 mg·L-1為基本培養基，附加不同濃度AgNO3與不同濃度NAA組合使用的培養基上，進行對生長芽分化培養的影響試驗。分化培養的前20 d進行暗培養，之后進行光照培養。生長芽的分化培養試驗每種培養基接種50個莖段，重復2次。

1.2.3 分化芽生根培養 將以上培養的分化芽從基部剪下，接種到1/3MS+ABT 2號（以下簡稱ABT）0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1為基本培養基，附加濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg·L-1的 IAA、IBA、NAA的培養基上，進行不同濃度生長素對分化芽生根的影響試驗。不同濃度生長素對分化芽生根的影響試驗重復2次，每種處理接種100個材料。

1.2.4 試管苗生根繼代增殖培養 把生根試管苗剪成長約1.5 cm、至少有2個生長點的莖段后，接種到1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L－１+IAA 0.4 mg·L-1培養基上，進行試管苗的生根繼代增殖培養試驗。試驗重復3次，每次繼代增殖培養6代，每代接種培養400個莖段。

1.2.5 試管苗的移栽、定植 將生根繼代增殖培養試管苗洗去根部的培養基，放到底部有一層約1 cm深干凈水層的塑料盤中，在光照下煉苗3 d后，將其移栽到上層為6～10 cm厚干凈河沙的溫室苗床上或花盆中。移栽后要保持前12 d遮光、溫度≥18 ℃、濕度約85%的環境條件。試驗重復2次，移栽株數分別為200株。其中每次盆栽10株，苗床栽190株。并在每個花盆中同時定植上3株沒有雜種優勢的實生苗進行對照。

當苗床上移栽成活的試管苗長出約3片新葉時，定植到大連郊區農田上，并同時定植實生苗。在花盆中移栽成活的試管苗有的搬到實驗室中。田間定植試驗重復2次，每次定植175株，定植實生苗20株。

2 結果與分析

2.1 不同濃度生長素對生長點伸長生長培養的影響

培養到40 d時觀察統計，結果見表1。在附加不同濃度IBA培養基上，生長點不能伸長生長；在附加不同濃度NAA和IAA培養基上，培養的生長點均能伸長生長；但在附加不同濃度IAA培養基上的伸長生長效果不及在附加不同濃度NAA的效果。在附加不同濃度NAA的培養基上生長點的伸長生長效果也有明顯差異。其中在附加濃度為0.3 mg·L-1的培養基上，生長點的伸長生長效果最理想，不僅生長率最高，生長芽長度最長，而且生長芽外觀長勢最好。對培養過程的觀察顯示，在附加濃度為0.3 mg·L-1的培養基上，培養6 d可見有的生長點開始生長；培養到40 d時，絕大多數生長點都能培養成為外觀上生長旺盛的生長芽。以上結果顯示，1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1這種培養基是雜種黃秋葵生長點伸長生長培養的理想培養基。

2.2 不同濃度的AgNO3與NAA組合使用對生長芽分化培養的影響

觀察顯示，在暗培養的條件下，培養到10 d左右時，在有的培養基上培養的生長芽上接觸到培養基的生長點開始分化。隨后，伴隨著分化率的不斷增加，先生長的芽基部又會分化出多個分化芽。培養到56 d時統計，結果見表2。在AgNO3 0.8 mg·L-1與濃度為NAA 0.1 mg·L-1組合使用的培養基上，生長芽分化的效果最理想，不僅分化率最高、平均分化的不定芽數最多，并且分化的分化芽長勢旺盛。對分化培養過程的觀察還表明，在AgNO3 0.8 mg·L-1與濃度為NAA 0.1 mg·L-1組合使用的培養基上，在暗培養期間形成的分化芽為淡黃色，轉入到光照培養6 d左右，伴隨著分化芽的不斷增加，分化芽也變成了綠色。并且所有的分化芽的基部都連在一起，使培養的分化芽呈叢生狀。2次重復試驗的結果基本一致。以上結果證明：MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO3 0.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1 這種培養基是雜種黃秋葵生長芽分化培養的理想培養基。

2.3 不同濃度的生長素對分化芽生根培養的影響

培養到34 d時觀察統計，綜合2次重復試驗結果證明，在附加濃度為0.4 mg·L-1 IAA的培養基上生根效果最好。在這一培養基上不僅平均生根率為94.3%、試管苗生根5.4條·株－１、葉片6.9個·株－１、莖粗0.23 cm、株高5.3 cm，而且外觀上試管苗長勢旺盛。結果說明，1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1這種培養基是雜種黃秋葵分化芽生根培養的理想培養基。

2.4 試管苗生根繼代增殖培養

試管苗繼代增殖培養的結果顯示：培養周期為30 d，所培養的試管苗平均生根率為96.8%、生根6.3條·株－１、株高5.1 cm，試管苗外觀上長勢旺盛，平均每個培養周期的繁殖系數為2.7。按照這個速度，1株試管苗1年可繁殖2.712（約為15萬）株試管苗，除掉各種不利因素的影響，1年能保證繁殖出10萬株試管苗。這種繁殖速度可滿足對黃秋葵野生資源保護和實現栽培的需要。這也證明1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1這種培養基也是雜種黃秋葵試管苗生根繼代增殖培養的理想培養基。

2.5 試管苗的移栽、定植

移栽后30 d對苗床統計表明：第一次移栽成活177株，第二次183株，兩次共成活360株，平均成活率為94.7%。

定植后40 d時統計顯示：2次共成活341株，平均成活率為97.4%。觀察表明，定植的具有雜種優勢的試管苗容易成活、生長速度快，根系發達而潔白，外觀上生長旺盛整齊。在花盆中和田間定植成活的雜種黃秋葵試管苗均在定植成活后84 d開花，113 d結出成熟的果實，并且植株生長旺盛，而在花盆中播種和田間播種的對照苗不僅幾乎不開花結果，并且長勢較弱。這說明本研究獲得的試管苗仍具有雜種優勢。

3 結論與討論

采用莖尖和試管苗培養的方法，以黃秋葵生長點為材料，進行了生長點的生長、分化芽的生根和試管苗的生根繼代增殖培養，以及試管苗的移栽與定植的研究。結果表明： 1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是雜種黃秋葵生長點伸長生長培養的理想培養基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是雜種黃秋葵生長芽分化培養的理想培養基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是雜種黃秋葵分化芽生根培養和生根繼代增殖培養的理想培養基。移栽后30 d平均成活率為94.7%。定植后40 d平均成活率為97.4%。

本研究通過莖尖和試管苗的培養，使具有雜種黃秋葵的種質得到了保存。這不僅證明采用莖尖和試管苗培養的方法能使黃秋葵自然雜種的雜種優勢種質得到保存，而且這一技術也為其它栽培植物的非人工有利變異的種質保存提供新途徑。

在本研究的試管苗繼代增殖培養研究中，每個繼代周期為30 d，而在分化芽的生根培養研究中的培養周期為34 d。同是生根培養，前者比后者縮短了4 d。出現這種現象的原因：一是前者使用材料為試管苗的莖段，后者使用的材料為分化芽。莖段的長勢比分化芽旺盛，對環境的適應性強。二是分化芽是在分化培養基上形成的，而試管苗的莖段是在生根培養基上生長的。生根繼代培養與生根培養使用的是相同的培養基。因此，后者在接種培養前，已經對培養基形成了適應性。

參考文獻：

[1] 中國科學院北京植物所.中國高等植物圖鑒（第二冊）[M].北京：科學出版社，1972：814.

[2] 中國科學院中國植物志編撰委員會.中國植物志 （第四十九卷：第二冊）[M].北京：科學出版社，1984：56-58.

[3] 南京中醫藥大學.中醫藥大辭典（上冊） [M].上海：上海科學技術出版社，2006：528-529.

[4] 吳燕春，謝金群.黃秋葵的研究進展[J].中醫藥學刊，2005，23（10）：1898-1899.