種子處理對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病的防治效果

摘 要： 利用干燥與藥劑相結(jié)合、引發(fā)與藥劑相結(jié)合的種子采后處理方法對(duì)西瓜種子的除菌效果進(jìn)行了研究。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)未經(jīng)人工接種的西瓜種子，幼苗生長(zhǎng)方法檢測(cè)人工接種和自然帶菌（Ac）的西瓜種子，結(jié)果表明，未經(jīng)人工接種的西瓜種子中，從沒(méi)有發(fā)酵經(jīng)室內(nèi)陰干4 h后熱風(fēng)烘干、以及不管是否發(fā)酵室內(nèi)陰干的種子上均檢測(cè)到Ac菌的特異性條帶。人工接種Ac菌的西瓜種子隨著室內(nèi)陰干時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗細(xì)菌性果斑病（BFB）的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，由陰干 3 h的0.9% 上升到陰干 6 h的20.4%。同時(shí)隨著陰干時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的成苗率降低，由陰干 3 h 的52.6%下降到陰干6 h的23.9%。說(shuō)明快速干燥能有效控制帶菌種子幼苗BFB的發(fā)生，提高種子的健康質(zhì)量。不同殺菌劑對(duì)自然帶菌（Ac）西瓜種子殺菌效果的研究結(jié)果表明，不管是藥劑處理種子還是含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理種子，其種子質(zhì)量都沒(méi)有顯著的差別。藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質(zhì)量均高于含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理的種子幼苗的鮮質(zhì)量。通過(guò)幼苗生長(zhǎng)鑒定，含藥固體基質(zhì)引發(fā)處理的相對(duì)防治效果在57.1%～78.6%之間，而藥劑處理的相對(duì)防治效果在84.6%～100.0% 之間。含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理對(duì)降低幼苗BFB發(fā)病率的效果要差。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 細(xì)菌性果斑病； 種子處理； 快速干燥； 防治效果

瓜類細(xì)菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，簡(jiǎn)稱BFB）是一種嚴(yán)重危害葫蘆科作物的世界性病害，尤其以危害西、甜瓜為重。西瓜細(xì)菌性果斑病最早于1965年由Webb等[1]首次在美國(guó)佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)，并對(duì)癥狀進(jìn)行了描述。當(dāng)Somodi[2]和Rane[3]等人報(bào)道了1989年在美國(guó)佛羅里達(dá)商品西瓜生產(chǎn)中的發(fā)病情況，接著先后在美國(guó)東南部10多個(gè)州再度嚴(yán)重發(fā)生西瓜細(xì)菌性果斑病，并導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失后，才真正引起了人們的重視，并稱之為西瓜細(xì)菌性果腐病。該病一旦發(fā)生，即可能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。從1989年以來(lái)，大多數(shù)年份美國(guó)發(fā)生該病的地塊不到5%，但是一旦受害，其損失有99%～100%。該病在美國(guó)印地安納州迅速蔓延后，80%的西瓜不能上市銷售。西瓜細(xì)菌性果斑病已對(duì)美國(guó)的西瓜制種業(yè)和種植業(yè)造成了巨大的沖擊和重大的威脅。目前該病還在土耳其[4]、澳大利亞[5]、日本[6]等國(guó)造成嚴(yán)重危害。

我國(guó)在1990年首次報(bào)道了BFB，隨后就相繼有人記載和報(bào)道了該病在國(guó)內(nèi)許多西甜瓜產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和危害[7-11]。該病發(fā)生在育苗階段，可造成嫁接幼苗大量死亡，在大田發(fā)生可造成西甜瓜減產(chǎn)甚至絕收，給西甜瓜生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。瓜類細(xì)菌性果斑病可經(jīng)種子傳播，我國(guó)作為國(guó)際上很多大型種子公司的制種基地，由于細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，使得美國(guó)的部分瓜農(nóng)不愿意使用中國(guó)生產(chǎn)的種子，致使國(guó)際上一些瓜類制種商先后撤出中國(guó)，使中國(guó)的西瓜制種業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

該病主要通過(guò)種子帶菌傳播，在生產(chǎn)上使用健康無(wú)菌的種子是防止細(xì)菌性果斑病發(fā)生和傳播的關(guān)鍵措施，目前迫切需要行之有效的種子滅菌處理技術(shù)。國(guó)外有關(guān)種子滅菌處理早有報(bào)道[12-14]，目前我國(guó)也有不少相關(guān)研究[15-19]，但是單一一種處理方法都無(wú)法對(duì)種子進(jìn)行完全消毒。本研究旨在摸索多種方法的綜合應(yīng)用對(duì)采后種子進(jìn)行處理，從而減少種子帶菌給西甜瓜生產(chǎn)所造成的巨大損失。

1 材料和方法

1.1 快速烘干對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病種子帶菌的影響

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)選用2種類型的種子：不經(jīng)人工接種的西瓜種子、人工接種的西瓜種子。從沒(méi)有發(fā)現(xiàn)西瓜細(xì)菌性果斑病疫情的大田新鮮西瓜上采集種子作為不經(jīng)人工接種的西瓜種子，分成2部分：一部分種子馬上沖洗干凈，另一部分種子發(fā)酵48 h，沖洗干凈，分別分成4份進(jìn)行以下處理：（1）馬上烘干，烘干時(shí)間為3 h；（2）室內(nèi)晾4 h后烘干；（3）1% 鹽酸處理15 min后烘干；（4）室內(nèi)自然晾干。種子的帶菌情況采用幼苗生長(zhǎng)和PCR技術(shù)對(duì)以上處理的種子進(jìn)行檢測(cè)。

人工接種的西瓜種子從市售的健康西瓜上采集，沖洗干凈后分成5份，其中4份立即用濃度為3×104 cfu·mL-1細(xì)菌性果斑病菌懸浮液浸泡30 min并進(jìn)行以下處理：（1）立即烘干；（2）室內(nèi)晾3 h后烘干；（3）室內(nèi)晾6 h后烘干；（4）室內(nèi)晾9 h烘干。另外 1份在室內(nèi)自然晾干后，在新鮮的西瓜汁液中浸泡2 h，然后用濃度為3×104 cfu·mL-1細(xì)菌性果斑病菌懸浮液浸泡30 min，自然晾干，采用幼苗生長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)病情況。

1.1.2 種子干燥處理 使用5HG-3550型滾筒烘干機(jī)在40 ℃ 的條件下烘干種子。種子快速烘干機(jī)是由北京蔬菜研究中心和現(xiàn)代農(nóng)裝科技股份有限公司共同研制的。

1.1.3 Ac菌懸液的制備 供試菌株為Pslbtw 20，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所提供；挑取保存的供試菌株在YDC斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水配成菌懸液，利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm測(cè)量菌懸液的OD值，用無(wú)菌水調(diào)整OD值在0.1左右（菌液濃度約為1×108 cfu·mL-1），再稀釋至3×104 cfu·mL-1，備用。

1.1.4 幼苗生長(zhǎng)鑒定 幼苗生長(zhǎng)鑒定在50穴的育苗盤內(nèi)進(jìn)行，基質(zhì)為經(jīng)高壓滅菌的蛭石，每一個(gè)穴內(nèi)播種1粒種子，育苗盤播種后用薄膜覆蓋保濕，放置在25～30 ℃、16 h光照的條件下生長(zhǎng)，出苗后去掉薄膜，每天觀察幼苗的發(fā)病情況，直到播種后3周。

1.1.5 種子帶菌的PCR檢測(cè) 提取種子的浸提液進(jìn)行PCR，每個(gè)處理檢測(cè)1 000粒種子混合樣品。PCR的引物組合為WBF1（5’-GAC CAG CCA CAC TGG GAC-3’）和WBF2（5’-CTG CCG TAC TCC AGC GAT-3’），由北京賽白盛公司合成。種子的浸提及PCR的方法按照宋順華等[20]的方法進(jìn)行。

1.2 藥劑處理帶菌種子對(duì)種子質(zhì)量的影響及防治效果

1.2.1 試驗(yàn)材料 供試藥劑：選用6種常用抗細(xì)菌的藥劑配制藥液，每種藥劑2個(gè)濃度，以無(wú)菌水和不處理作為對(duì)照：1%鹽酸，2%鹽酸；3%雙氧水，5%雙氧水；3%過(guò)氧乙酸，5%過(guò)氧乙酸；1 ∶ 100 physan 20，1 ∶ 80 physan 20；0.1% CuSO3，0.2% CuSO3；0.2% 農(nóng)用鏈霉素，0.4% 農(nóng)用鏈霉素。

種子：帶菌的西瓜種子為京欣2號(hào)，由北京蔬菜研究中心西瓜課題組提供。

采用2種方法處理種子。方法1：用以上濃度的藥液直接處理帶菌的西瓜種子。鹽酸溶液處理種子10 min，physan 20處理種子15 min，其他處理種子20 min，然后充分沖洗干凈。沖洗干凈的種子置于室內(nèi)自然晾干，保存在低溫條件下備用。方法2：藥劑處理與固體基質(zhì)引發(fā)結(jié)合。按照本試驗(yàn)室引發(fā)西瓜種子的方法[21]將以上濃度的藥液加入到固體基質(zhì)中處理種子，回干后的種子保存在低溫條件下備用。

1.2.2 種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)特性的測(cè)定 處理后的種子分別進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)：每處理50粒種子，4次重復(fù)，共200粒種子，發(fā)芽基質(zhì)為蛭石，發(fā)芽條件為25 ℃恒溫、16 h光照、8 h黑暗，計(jì)算種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率。發(fā)芽后14 d測(cè)定幼苗的生長(zhǎng)特性，連根拔出種苗，用水洗凈后放在濾紙上吸去多余水分。每處理隨機(jī)抽取50株苗，測(cè)量每株苗的長(zhǎng)度，稱量50株苗的總質(zhì)量，計(jì)算平均每株苗的長(zhǎng)度和鮮質(zhì)量。

1.2.3 防病效果的檢測(cè) 每處理播種500種子進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)鑒定，檢測(cè)各處理的滅菌防病效果，檢測(cè)方法同1.1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速烘干對(duì)種子帶菌的影響

對(duì)大田新鮮西瓜上所采集的西瓜種子進(jìn)行各種處理后，采用幼苗生長(zhǎng)鑒定方法檢測(cè)各處理幼苗細(xì)菌性果斑病的發(fā)病情況。由于所有處理種子所生長(zhǎng)的幼苗都很弱小，而且猝倒病嚴(yán)重，幼苗的成活率很低，特別是室內(nèi)自然晾干的種子幼苗的成苗率更低，沒(méi)有有效地觀察到幼苗的發(fā)病情況。

應(yīng)用PCR技術(shù)，從沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵在室內(nèi)晾干4 h后烘干的種子，以及不管是否經(jīng)過(guò)發(fā)酵，在室內(nèi)自然晾干的種子上均檢測(cè)到了病原菌Ac的特異性條帶（360 bp），結(jié)果為陽(yáng)性。不管是否對(duì)種子發(fā)酵，采種后快速烘干、鹽酸處理的種子及發(fā)酵后在室內(nèi)晾干4 h的種子均沒(méi)有檢測(cè)到Ac的特異性條帶（圖1），說(shuō)明種子發(fā)酵、采種后快速烘干、鹽酸處理均可阻止病原細(xì)菌在種子表面的繁殖，是防止種子帶菌的有效方法。

人工接種的西瓜種子采用幼苗生長(zhǎng)方法檢測(cè)結(jié)果表明，用菌懸液處理后的西瓜種子隨著室內(nèi)晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗細(xì)菌性果斑病的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，晾干 3 h以上時(shí)，幼苗的病株率急劇上升，由0.9%上升到晾干 6 h的20.4%。但是隨著晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗的死亡數(shù)量也在增加，成苗率降低，晾干 3 h以上時(shí)，種子的成苗率急劇降低，由52.6%下降到 6 h的23.9%（圖2）。由此說(shuō)明種子的快速烘干可以降低西瓜種子的帶菌率，降低幼苗細(xì)菌性果斑病的發(fā)病率，提高種子的健康狀況。

Ⅰ. 立即烘干；Ⅱ.室內(nèi)晾3 h后烘干；Ⅲ.室內(nèi)晾6 h后烘干；Ⅳ.室內(nèi)晾9 h烘干；Ⅴ.自然晾干

2.2 藥劑處理帶菌種子對(duì)種子質(zhì)量的影響及防治效果

2.2.1 藥劑處理對(duì)西瓜種子質(zhì)量的影響 不管是藥劑處理的種子還是含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理的種子，其發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與對(duì)照相比在5%的顯著性水平上都沒(méi)有明顯的差別，各處理之間也沒(méi)有明顯的差別（表1）。但藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質(zhì)量均高于含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理的種子（圖 3）。

2.2.2 不同藥劑處理對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病的防治效果 通過(guò)幼苗生長(zhǎng)鑒定，與對(duì)照相比，本文所選用的殺菌劑采用2種方法處理帶菌種子后，都顯著地降低了幼苗細(xì)菌性果斑病的發(fā)病率，各處理種子幼苗的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未處理的對(duì)照種子，對(duì)照幼苗的發(fā)病率為5.5%～6.0%，含藥固體基質(zhì)引發(fā)處理西瓜幼苗的發(fā)病率在1.5%～3.0% 之間，藥劑直接處理種子幼苗的發(fā)病率在0～1.0%之間（圖4），其相對(duì)防治效果分別為57.1%～78.6%、84.6%～100.0%（圖5）。含藥固體基質(zhì)引發(fā)處理種子對(duì)降低幼苗發(fā)病率的效果更差。

3 討 論

瓜類細(xì)菌性果斑病是一種典型的種傳病害，種子帶菌是主要的初侵染源，在合適的環(huán)境條件下，少量的帶菌種子能給葫蘆科作物生產(chǎn)田造成毀滅性的危害[22] ，因此帶菌的種子可成為商品西瓜甜瓜產(chǎn)區(qū)的重大隱患。生產(chǎn)健康的種子，防止種子帶菌和對(duì)帶菌種子進(jìn)行滅菌處理是有效控制該病在田間發(fā)生發(fā)展的主要措施之一[23]。健康種子的生產(chǎn)首先要避免從出現(xiàn)BFB疫情的大田及帶有典型BFB癥狀的西瓜上采種，但從沒(méi)有BFB典型癥狀的西瓜上所采收的種子也很難確定種子是否帶菌。其次種子采后進(jìn)行種子發(fā)酵和酸性物質(zhì)處理能極大地降低種子的帶菌率，如果在氣溫較低的條件下，發(fā)酵24 h的處理效果不理想，發(fā)酵72 h對(duì)種子的發(fā)芽率會(huì)產(chǎn)生影響，以發(fā)酵36～48 h較為適宜，但沒(méi)有100% 的有效[13-14]，因?yàn)椴≡梢郧秩镜椒N子的內(nèi)部[24]，種子發(fā)酵不能殺死種子內(nèi)部的病原菌，也有可能是種子發(fā)酵后在干燥過(guò)程中再次感染病原菌。

本研究采種的大田西瓜植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BFB，所采集的西瓜種子籽粒很小，在苗盤播種后發(fā)芽整齊但很弱小，因此在有利于BFB發(fā)病的高溫高濕條件下猝倒病嚴(yán)重，造成成苗率很低，沒(méi)有有效的檢測(cè)到幼苗BFB的發(fā)病情況。本試驗(yàn)采用PCR方法，不管是種子發(fā)酵還是不發(fā)酵，從采種后立即烘干的種子、鹽酸處理過(guò)的種子以及發(fā)酵48 h 后晾干4 h以內(nèi)迅速干燥的種子上均沒(méi)有檢測(cè)到病原菌的特異性DNA片段。采用幼苗生長(zhǎng)方法檢測(cè)人工接種病原菌的西瓜種子，隨著室內(nèi)晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗BFB的發(fā)病率上升，幼苗的成苗率降低；晾干 6 h種子的成苗率與晾干3 h相比急劇下降，其中一部分原因是幼苗的猝倒病而引起的。由此說(shuō)明種子的快速干燥可以降低西瓜種子的帶菌率，從而降低幼苗BFB的發(fā)病率，提高種子的健康質(zhì)量。本研究的結(jié)果表明，采后使種子表面干燥的時(shí)間不能超過(guò)4 h，種子發(fā)酵、采種后快速干燥、鹽酸處理均可阻止病原細(xì)菌在種子表面的繁殖，將這些處理措施綜合使用是防止種子帶菌的有效方法。

殺菌劑處理帶菌種子的研究結(jié)果表明，生產(chǎn)上經(jīng)常使用的6種抗細(xì)菌的藥劑分別用2種方法和2種濃度處理種子后，與對(duì)照相比，對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都沒(méi)有影響，但幼苗的平均鮮質(zhì)量在2種方法之間有明顯的差別，除5% 的雙氧水外，其余的殺菌劑用含藥的固體基質(zhì)處理后，與藥液直接處理種子相比，可減輕幼苗的鮮質(zhì)量。這可能是含藥的固體基質(zhì)處理種子是一種引發(fā)的過(guò)程，處理時(shí)間較長(zhǎng)，在這個(gè)過(guò)程中種子緩慢吸收了藥液到種子內(nèi)部，對(duì)幼苗產(chǎn)生影響。從各處理對(duì)幼苗BFB的防治效果可以看出，相同濃度的藥液通過(guò)固體基質(zhì)引發(fā)處理種子，其殺菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及藥液直接處理種子。本試驗(yàn)中將一定濃度的殺菌劑加入固體基質(zhì)，是為了使種子引發(fā)與殺菌同時(shí)完成。以后的研究還需進(jìn)一步摸索固體基質(zhì)中藥劑的種類和適宜的濃度，達(dá)到既能使種子不攜帶病原菌又不影響種子質(zhì)量、出苗整齊的目的。

4 結(jié) 論

快速干燥可以降低西瓜種子上Ac的帶菌率，從而降低幼苗BFB的發(fā)病率，提高種子的健康質(zhì)量，采后使種子表面干燥的時(shí)間不能超過(guò)4 h，種子發(fā)酵、采種后快速干燥、鹽酸處理均可阻止病原細(xì)菌在種子表面的繁殖，將這些處理措施綜合使用是防止種子帶菌的有效方法。所選用的藥劑和濃度，不管是藥劑直接處理種子還是含藥的固體基質(zhì)引發(fā)處理種子，其種子質(zhì)量都沒(méi)有顯著的差別。藥劑處理的種子平均每株幼苗的鮮質(zhì)量均高于含藥固體基質(zhì)引發(fā)處理的種子，含藥固體基質(zhì)引發(fā)處理對(duì)降低幼苗BFB發(fā)病率的效果比藥劑直接處理種子要差。

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