常見臨床標本的微生物檢驗程序

摘要：目的：探討常見臨床標本的微生物檢驗程序。

方法：以白色念珠菌為例，建立白色念珠菌臨床標本的檢驗方法與檢驗程序。

結果：白色念珠菌在沙氏葡萄糖培養基中，35℃時生長狀態較好；顯色培養基上25℃時生長較慢，菌落為乳白色，35℃時生長良好，菌落為淺綠色；在吐溫80-玉米粉培養基、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基上生長較為緩慢。白色念珠菌蔗糖發酵試驗陰性，葡萄糖、麥芽糖發酵試驗陽性，尿素分解試驗陰性。

結論：盡管各微生物的生化特性千差萬別，但對其進行的檢驗程序大致是相同的，都必須進行標本分離、菌種鑒定、藥敏試驗三個步驟。

關鍵詞：臨床標本白色念珠菌微生物檢驗程序



【中圖分類號】R4【文獻標識碼】A【文章編號】1008-1879（2012）10-0006-01

臨床微生物檢驗程序主要包括三個步驟，即標本分離、菌種鑒定、藥敏試驗，其中，菌種鑒定過程的速度是決定微生物檢驗過程快慢的決定因素¹。建立合理的微生物檢驗方法與檢驗程序對提高檢驗結果的準確性與檢驗速度具有重要的作用。白色念珠菌是臨床標本中常見的酵母樣真菌。本文以白色念珠菌為例，探討常見臨床標本的微生物檢驗程序。

1材料與方法

1.1材料。菌株為白色念珠菌標準株（ATCC 10231）、熱帶念珠菌。培養基有沙氏葡萄糖瓊脂/液體培養基、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基、乳糖/蔗糖/麥芽糖/葡萄糖發酵培養基、血培養基、吐溫80-玉米粉培養基。

1.2方法。首先制備菌液，挑取斜面培養基培養的新鮮培養物接種至液體沙氏葡萄糖培養基中，置于25℃培養24或48小時后，將菌液稀釋成30～100cfu/ml。取1ml菌液分別置于沙氏葡萄糖瓊脂培養基、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基和吐溫80-玉米粉培養基，在不同的溫度25℃、35℃、38℃下，培養1、2、3、4、5天后，計數活菌數并進行比較。

挑取沙氏葡萄糖瓊脂培養基、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基和吐溫80-玉米粉培養基中的菌落接種于顯示培養基中，于25℃培養24小時后，觀察顯色情況并用顯微鏡觀察菌落形態。

挑取沙氏葡萄糖瓊脂培養基、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基和吐溫80-玉米粉培養基中的菌落進行生化試驗（糖發酵試驗、尿素分解試驗）。

2結果

白色念珠菌在沙氏葡萄糖培養基中，35℃時生長狀態較好，活菌數高于25℃培養條件下的活菌數。在沙氏葡萄糖培養基上，白色念珠菌的菌落呈圓形、乳白色、大小為5微米左右，較粘稠，菌落中央突起。革蘭氏染色呈陽性，菌體呈不均勻著色，芽管與假菌絲不清晰。

白色念珠菌在顯色培養基上25℃時生長較慢，菌落為乳白色，較小；35℃時生長良好，菌落為淺綠色，隨著生長時間的延長，菌落顏色可逐漸加深至綠色。熱帶念珠菌菌落為藍綠色，隨生長時間延長可逐漸加深至深藍色。

顯微鏡觀察白色念珠菌經革蘭氏染色后，菌體著色不均，可見厚膜孢子以及模糊不清的假菌絲。利用顯色培養基可以將酵母菌與假絲酵母菌區分，同時也可將白色念珠菌與熱帶、克柔、光滑酵母菌相鑒別。

白色念珠菌在吐溫80-玉米粉培養基上生長較為緩慢，在顯微鏡下可見大量假菌絲以及厚膜孢子。白色念珠菌在氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂培養基上生長也較為緩慢，菌落較小。白色念珠菌在血培養基上生長迅速，在顯微鏡下可見大量假菌絲以及厚膜孢子。

生化試驗結果顯示，白色念珠菌蔗糖發酵試驗陰性，葡萄糖、麥芽糖發酵試驗陽性，尿素分解試驗陰性；熱帶念珠菌蔗糖、葡萄糖、麥芽糖發酵試驗陽性，尿素分解試驗陰性。

3討論

白色念珠菌，即白假絲酵母菌，是一種條件致病菌。患者感染白色念珠菌后可引起腦膜炎、肺炎、心內膜炎、陰道炎、鵝口瘡甚至敗血癥等疾病²。

微生物檢驗方法參照《中國藥典》中相關檢驗方法。首先將供試品制成10倍稀釋的供試液。取出10ml供試液后加入100ml沙氏培養基中，置于35℃培養箱內培養48小時，進行增菌。真菌大量增殖后逐漸沉淀于培養瓶底部。繼而將增菌后的培養液取出少量于顯色培養基中進行四區劃線，將顯色培養基置于35℃培養箱內培養72小時，培養結束后將培養基取出觀察菌落的顏色。在顯色培養基上，白色念珠菌的菌落應為綠色，菌落大小為直徑約2μm，熱帶念珠菌的菌落應為深藍色，菌落大小為直徑約1.5μm，克柔念珠菌的菌落應為粉紅色，菌落大小為直徑約4.5μm，光滑念珠菌的菌落應為紫色，菌落大小為直徑約2μm，其他種類念珠菌的菌落為白色，菌落大小不定。

將增菌后培養液取出1ml加入吐溫80-玉米粉培養基、血培養基中，置于35℃培養箱內培養48小時。挑取典型菌落涂片后置于顯微鏡下使用高倍鏡觀察真菌假菌絲與芽管。在顯微鏡下可見白色念珠菌有較多厚膜孢子。

最后將顯色培養基上生長良好，菌落典型的念珠菌接種于各生化培養基上進行生化試驗。真菌生化試驗主要有蔗糖、葡萄糖、麥芽糖發酵試驗以及尿素分解試驗。將其置于35℃培養箱內培養48小時后，對結果進行觀察與分析。根據所有試驗結果進行菌種鑒定。

由此可見，對臨床標本進行微生物檢驗時，不同病原菌具有不同的生長與生化特點，盡管各微生物的生化特性千差萬別，但對其進行的檢驗程序大致是相同的，都必須進行標本分離、菌種鑒定、藥敏試驗三步驟。

參考文獻

[1]Derby P， Davies R， Oliver S. The value of including broth cultures as part of a routine culture protocol [J].J ClinMicrobiol，2007， 35： 1101-1102

[2]Clark AG， McLauchlin J. Simple color tests based on an alanyl peptidase reaction which differentiate Listeria monocytogenes from other Listeria species [J]. J Clin Microbiol， 2007，35：2155-2156