柱凝膠技術在輸血前抗體篩檢中的應用分析及方法學探討

[摘要] 目的 對6463例輸血、妊娠史的受血者進行不規則抗體（IAb）篩查，并評估微柱凝膠技術（MGT）、聚凝胺技術（MPT）和抗人球蛋白試管法（CTT）在輸血前抗體篩檢中IAb陽性標本的應用價值。 方法 IAb抗D、抗E陽性者，用三種方法進行連續倍比稀釋效價比對，檢測其靈敏度。 結果 抗D抗體三種方法靈敏度檢測差異無統計學意義（P > 0.05）；抗E抗體檢測MPT法與CTT法差異無統計學意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 檢測中發現MGT的靈敏度最高，其靈敏度較MPT高2～4個滴度，較CTT法高出3～5個滴度，往往MPT法和CTT法對IAb較弱的標本為陰性時，MGT法仍能檢出。MGT法操作簡便、省去洗滌步驟、重復性好，易于批量和標準化操作，適于在血型血清學的檢測中廣泛應用。

[關鍵詞] 柱凝膠技術；不規則抗體；聚凝胺技術；抗人球蛋白試驗

[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）28-0111-03

抗體篩選是輸血前檢查的重要項目之一。通過抗體篩選可以避免含有弱抗體的受血者輸入含有相應抗原的紅細胞而受到免疫刺激， 甚至發生溶血性輸血反應， 同時也為受血者尋找相合的血液提供理論依據。不規則抗體（IAb）是指ABO血型系統抗A、抗B以外的血型抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應及疑難配型的主要原因，多為IgG抗體，患者反復多次輸血和妊娠可產生免疫性抗體導致遲發性輸血反應，輸血前及時檢測患者血清中IAb，是安全輸血的重要保證，我院開展柱凝膠技術（MGT）對所有輸血、妊娠史的受血者進行IAb篩查，并對IAb陽性標本用微柱凝膠技術（MGT）、聚凝胺技術（MPT）、抗人球蛋白試管法（CTT）三種方法進行對比分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

2007年11月～2011年10月本院手術備血和治療用血的受血者6 463例，其中男3 602例，女2 861例，年齡1～95歲。

1.2 儀器與試劑

微柱凝膠卡、專用孵育箱和離心機，均為長春博迅生物技術有限公司提供，Lab篩檢細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜細胞為上海血液生物有限公司產品；IgG抗-D血清由上海生物醫藥制品有限公司提供；抗人球蛋白血清抗IgGC3由上海市血液生物有限公司提供，MPT試劑盒（中山生科試劑儀器有限公司產品）；O 型試劑紅細胞的制備：取3 個不同O 型RhD 陽型獻血員的紅細胞混合，用0.9% 生理鹽水洗滌3 次。將洗滌好的紅細胞用0.9%生理鹽水配成濃度為0.8%紅細胞懸液備用。

1.3 方法

受血者抽取EDTA-k2抗凝血3 mL，標本必須是輸血前3 d，分離血漿離心5 min。

1.3.1 微柱凝膠卡式法（MGT） 微柱卡編號，向標記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的三個微柱反應孔各加0.8%～1.0%篩檢細胞50 μL，再向對應微柱管中加入受檢者血漿50 μL，每次均設陰陽性對照，置37℃孵育器15 min，專用離心機離心5 min，900 rpm 2 min，1 500 rpm 3 min，取出觀察結果，紅細胞相互凝集處于凝膠柱的上方為陽性，反之，篩檢細胞能通過分離柱，沉降到凝膠柱底部為陰性。用1～10號譜細胞采用微柱凝膠法，作抗體特異性鑒定。

1.3.2 聚凝胺法（MPT）檢測Lab 待測管加受血者血漿1滴，加3%～5%篩檢細胞懸液1滴，各管加低離子介質（LIM）3滴，混勻，室溫放置30 s，加入polyberne試劑2滴，3 500 r/min離心15 s輕搖，肉眼可見明顯凝集，各管加假凝集稀釋液1滴，輕搖，非特異性凝集1 min后消失為陰性，反之為陽性。

1.3.3 試管法間接抗人球蛋白試驗（CTT） 2滴受血者血漿與1滴5%篩檢細胞混合后至37℃孵育1 h，生理鹽水洗滌紅細胞3次，將洗滌后的紅細胞加入抗人球蛋白試劑于3 000 rpm離心15 s，顯微鏡觀察，陽性對照和被檢管出現凝集，即為陽性，而陰性管不凝集。

1.3.4 比對MGT、CTT、MPT靈敏度，對不完全抗體陽性抗E和抗D受檢者血漿，用生理鹽水進行連續倍比稀釋，1∶2至1∶1 024，稀釋后的血漿按抗體篩選方法做效價測定，反應到達1+的最大稀釋倍數為該抗體的效價，稀釋后的紅細胞懸液用傳統抗球蛋白法進行檢測.平行實驗重復5次。

1.4 統計學方法

采用SPSS13. 0 統計學軟件進行分析。采用幾何平均值計算法，計算CTT法與MGT法測抗-D和抗E效價的平均值，CTT法與MGT、MPT法靈敏度檢測結果比較采用幾何均數法的t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種方法對28例抗D、抗E抗體陽性效價比較

MGT法測定IAb，將抗D、抗E陽性受血者標本連續倍比稀釋為1∶2至1∶1 024進行檢測，結果紅細胞懸浮在凝膠柱的上方和中間，由強到弱有肉眼可見的凝集顆粒，陽性的最高稀釋度效價為1∶1 024；MPT法測定的最高稀釋度為1∶64時肉眼可見明顯的凝集，1∶128顯微鏡下可見紅細胞呈弱凝集；CTT法測定，在最高稀釋度為1∶64時肉眼可見明顯的凝集，1∶128顯微鏡下未見凝集。見表1。對抗體陽性標本采用血清半定量三種方法檢出率分別為MGT法100%，MPT法90%，CTT法72%，對抗D抗體三種方法靈敏度檢測，MPT法與CTT法差異無統計學意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有統計學意義（P < 0.01）。

2.2 52例Lab陽性抗體分布

采用MGT法對6 463例受血者進行不規則抗體篩查，MPT法篩檢出IAb陽性52例，陽性率0.80%（52/6 463），其中男22例，女30例，男性均有輸血史，女性12例有輸血史，25例有妊娠史，其中7例既有妊娠史又有輸血史。用MGT法進一步作特異性抗體分型，鑒定出特異性39例、抗D 18例、抗E 10例、抗C 2例、抗c 2例， 抗-Mia 1例、抗-Jka 2 例、抗-Lea 1例、自身抗體3例、未鑒定出特異性抗體13例。見表2。抗E效價抗體效價比對，MPT法與CTT法差異無統計學意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有高度統計學意義（P < 0.01），顯示CTT法和MPT法在IAb較弱時可造成漏檢。

表1 三種方法對28例抗D、抗E抗體陽性效價比較

3 討論

在6 463例受血者血清中檢出IAb 52例，陽性率0.80%（52/6 463），高于國內文獻報道[1]。IAb的產生可導致輸血人群遲發性免疫溶血反應，嚴重者可危及生命。被檢出的52例IAb陽性患者中，18例抗D患者，年齡35～73 歲，抗D 的產生主要是《臨床輸血技術規范》實施前輸血的患者或是有多胎孕產史的患者。10例抗E 患者有8例為血液病和腫瘤病患者，均有2 年以上輸血史。臨床上抗E 引起的溶血反應發生率約占Rh 血型系統溶血反應30.7%。采用CTT法對52例陰性標本進行檢測，其中抗-Lea抗體未檢出，CTT法需3 次洗滌紅細胞， 可能將紅細胞表面的Lea 抗原洗脫， 從而造成陰性反應。據報道每輸1u紅細胞使受血者產生同種抗體的幾率為1%～1.6%，多次輸血產生同種抗體的幾率為15%～30%，Rh陰性患者輸入1u的Rh陽性紅細胞懸液，有80%患者在2～5個月內產生抗D[2]。Rh抗原強弱的順序D>E>c>C>e。Rh血型系統是紅細胞血型中最復雜的血型系統，被視為臨床上產生溶血性輸血反應的主要原因之一，抗D是引起輸血反應最嚴重的一種，在輸血工作中，除ABO同型輸注外，Rh系統中考慮D抗原陰性患者輸血的同時，更應加強E抗原相同配血，可大大降低IAb產生概率。

對28例抗D、抗E陽性標本，用MGT 、CTT、MPT三種方法做抗體效價比對，結果顯示MGT的靈敏度最高。研究發現，MGT 法檢測抗D 的靈敏度為5 ng/mL， 而CTT法檢測的靈敏度為11 ng/mL。MGT法檢測抗D 的靈敏度高于CTT檢測[3]，與我們的研究結果一致。檢測中發現MGT的靈敏度最高，其靈敏度較MPT高2～4個滴度，較CTT法高出3～5個滴度，往往MPT法和CTT法對IAb較弱的標本為陰性時，MGT法仍能檢出，可以檢測Rh 、MNSs、Duffy、kelL、Lewis、p 等血型系統的抗體，IAb多為IgG抗體，主要通過輸血和妊娠及不明原因的類抗原刺激產生免疫刺激產生，在鹽水介質中不能凝集，而只能致敏相應抗原的紅細胞，經典的間接抗球蛋白法操作繁瑣、敏感性低且費時，很難在臨床推廣[4]，通過實際操作發現，受血者采用MGT法進行IAb篩查陰性者，交叉配血時無不和現象，提高了配血成功率。對IAb陽性標本繼續作抗體鑒定，提前準備相合的血液，避免和減少因免疫性輸血反應的發生。

MGT是血型血清學方法的一項新的免疫學檢測技術，通過微柱凝膠的微孔過濾作用和抗原抗體特異性反應作用，經低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發生凝集反應的紅細胞阻滯于凝膠上層，呈陽性，而游離的單個紅細胞，則穿過微孔到達凝膠底部，呈陰性反應，由于凝膠中已經含有抗IgGC3和各種血型抗體，從而簡化了實驗過程，應用微柱凝膠法進行間接抗人球蛋白試驗可免去洗滌紅細胞步驟[4]，只需加入樣本即可。由于采用了混合細胞進行檢測，涵蓋的抗原數目增多，可以盡可能多地檢出臨床有意義的抗體，為安全輸血提供了保障。MGT法對標本要求高，標本與標準紅細胞都應保證新鮮，無細菌污染，標本及時檢驗，制備的紅細胞懸液不能超過1%，加樣前樣本離心5 min，要充分除去纖維蛋白，為避免血漿蛋白的影響，保證結果的正確判讀，應先加入篩選紅細胞，紅細胞濃度要適當（0.5%）；要每次做陰陽性對照； 篩選陽性時要用試管法復查對照，肝素抗凝血可造成IAb假陽性，必須使用EDTA抗凝血標本，否則易引起假凝集、不抗凝標本，由于不能充分去除纖維蛋白使其在微柱凝膠中析出，阻礙了陰性紅細胞沉淀，也會呈假陽性反應；MGT法在溫箱內孵育15 min，可有效消除冷凝集素的影響，因此孵育時間要充分，并要控制室溫。

MGT法結果直觀可靠、無需顯微鏡觀察、重復性好、易于批量和標準化操作、標本用量少、減少了操作污染，在醫院輸血科，尤其是標本量大的大型綜合性醫院中有必要將MGT作為輸血前IAb常規檢測項目推廣使用。通過實踐應用發現，采用微柱凝膠技術篩檢受血者IAb可避免含有抗體的受血者輸入含有相應抗原的紅細胞而受到免疫刺激，選擇相配合的血液輸注；對受血者采用MGT方法進行常規抗體篩查陰性者，在交叉配血時無不和現象，大大提高了配血成功率，減少了免疫性溶血性輸血反應的發生。

[參考文獻]

[1] 曹榮祎，劉鳳華，于洪敏. 微柱凝膠法檢測不規則抗體的臨床應用[J]. 臨床輸血與檢驗，2010，12（2）：149-l51.

[2] 陳靜，馬濤. 微柱凝膠技術篩選及鑒定不規則抗體的臨床應用[J]. 河北醫藥，2008，8（30）：1233-1234.

[3] Aubuchon JP，de Wildt-Eggen J，Dumont LJ. Reducing the variation in performance of antibody titrations[J]. Arch Pathol Lab Med，2008，132：1194-1201.

[4] 孔祥騫，吳松遠，楊作云. 低離子聚凝胺技術在臨床輸血檢驗中的應用價值探討[J]. 實用醫學雜志，2009，25（6）：983.

（收稿日期：2012-07-30）