用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估檢測(cè)體系的最低檢出限

[摘要] 目的 建立一套基于非參數(shù)統(tǒng)計(jì)原理的評(píng)估方案，用于空白標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為非正態(tài)分布、標(biāo)準(zhǔn)曲線為非直線線性的檢測(cè)體系最低檢出限（limit of detection，LoD）的確定。 方法 根據(jù)數(shù)據(jù)分布模型，以非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法確定空白標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的第95百分位數(shù)作為空白檢測(cè)限（limit of blank，LoB），通過(guò)LoD=LoB+tβ×s低值的數(shù)學(xué)模型來(lái)評(píng)估LoD。 結(jié)果 以非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法建立的評(píng)估程序可通過(guò)驗(yàn)證程序證明該LoD值有效。 結(jié)論 對(duì)于空白標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果不符合正態(tài)分布，標(biāo)準(zhǔn)曲線為非直線線性的資料可用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的評(píng)估方法來(lái)確定LoD。

[關(guān)鍵詞] 最低檢出限；非參數(shù)統(tǒng)計(jì)；非正態(tài)分布

[中圖分類號(hào)] R311 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）28-0108-03

根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)（ISO）要求，在確定檢測(cè)體系的最低檢出限（LoD）時(shí)盡量避免Ⅰ（α）類和Ⅱ（β）類統(tǒng)計(jì)學(xué)錯(cuò)誤的發(fā)生[1-4]，ISO制定的一系列評(píng)估方案已考慮到這一問(wèn)題，但都基于參數(shù)統(tǒng)計(jì)原理設(shè)計(jì)[5，6]，只適用于空白標(biāo)本測(cè)定結(jié)果符合正態(tài)分布、標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線線性的檢測(cè)體系LoD的確定。但實(shí)際工作中有些儀器不報(bào)告吸光度、熒光強(qiáng)度等原始響應(yīng)量，對(duì)于小于零的擬合結(jié)果直接報(bào)告為零或較小的正值，導(dǎo)致空白標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不符合正態(tài)分布規(guī)則。此外，很多定量檢測(cè)項(xiàng)目特別是基于抗原-抗體反應(yīng)原理的檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線并不符合一元一次直線線性[2，5，7]，而是復(fù)雜的曲線線性。針對(duì)以上不適合采用參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估檢測(cè)體系LoD的情況，應(yīng)建立一種新的采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)原理設(shè)計(jì)的LoD評(píng)估方案來(lái)確定檢測(cè)體系的LoD。

1 參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法的理論基礎(chǔ)及應(yīng)用局限

理論上，空白標(biāo)本由于不含有待測(cè)物，其真實(shí)濃度（μβ）為零，但由于空白響應(yīng)量并不是一個(gè)固定值，其波動(dòng)服從正態(tài)分布規(guī)律，因此對(duì)空白標(biāo)本進(jìn)行多次檢測(cè)所得到的檢測(cè)結(jié)果并不總是等于零。以均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）表示空白響應(yīng)量的集中位置和離散程度，單次檢測(cè)的空白響應(yīng)量有95%的概率分布在區(qū)間[x-2·s，x+2·s]內(nèi)。在確定方法學(xué)性能或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)常常以x作為校準(zhǔn)至零點(diǎn)的基準(zhǔn)，其對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度（x空白）定為零。各個(gè)檢測(cè)樣品的反應(yīng)響應(yīng)量減去x就是該標(biāo)本中待測(cè)物產(chǎn)生的響應(yīng)量，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)物濃度。由于空白響應(yīng)量有波動(dòng)，因此空白標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)對(duì)稱分布在x空白的兩側(cè)，大于0和小于0的概率都是50%，符合正態(tài)分布規(guī)則，空白標(biāo)本單次檢測(cè)結(jié)果有95%的概率在區(qū)間[x空白-2·s空白，x空白+2·s空白]內(nèi)，在此區(qū)間外的概率只有5%。以該區(qū)間的上限值（x空白+2·s空白）作為空白檢測(cè)限（limit of blank，LoB），只有檢測(cè)結(jié)果高于LoB時(shí)才認(rèn)為標(biāo)本中確實(shí)含有待測(cè)物。對(duì)于小于或等于LoB的檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為是由空白標(biāo)本單次檢測(cè)的空白響應(yīng)量波動(dòng)造成，可報(bào)告“無(wú)分析物檢出”。但部分儀器無(wú)法給出原始響應(yīng)量，而是直接報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，并將負(fù)值結(jié)果自動(dòng)轉(zhuǎn)換為零或者指定的檢測(cè)低限，無(wú)法給出負(fù)值的檢測(cè)結(jié)果。從醫(yī)學(xué)角度分析，患者血清或其他體液標(biāo)本中某待測(cè)物的含量不可能為負(fù)值，儀器對(duì)負(fù)值結(jié)果的轉(zhuǎn)化是合理的，但這種偏態(tài)分布資料不適合采用參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法通過(guò)x空白和s空白來(lái)確定該檢測(cè)體系的LoB[8，9]。否則得到的LoB要明顯大于真實(shí)的LoB[8]，從而導(dǎo)致很大一部分低濃度標(biāo)本被誤判為陰性，而出現(xiàn)“假陰性”的報(bào)告。

2 非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法的理論基礎(chǔ)

2.1 Ⅰ類錯(cuò)誤與LoD的關(guān)系

2.2 Ⅱ類錯(cuò)誤與LoD的關(guān)系

3 非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的評(píng)估程序

3.1 空白標(biāo)本和低值標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)

空白標(biāo)本的物理性狀和基質(zhì)成分應(yīng)盡可能接近患者標(biāo)本，如果患者常規(guī)標(biāo)本為血清或血漿標(biāo)本，則應(yīng)選擇不含待測(cè)物的血清或血漿標(biāo)本作為空白標(biāo)本而不是非血清基質(zhì)的緩沖液。由于不同來(lái)源的標(biāo)本可能存在不同的基質(zhì)效應(yīng)以及形成不同的內(nèi)源性復(fù)合物，為確保評(píng)估過(guò)程中的檢測(cè)具有代表性，應(yīng)選擇多份空白標(biāo)本（建議5～10份甚至更多），每份標(biāo)本多次測(cè)定。低濃度標(biāo)本也同樣采用一系列（至少5～10例）不同患者來(lái)源的血清/血漿標(biāo)本，每份標(biāo)本進(jìn)行5～10次重復(fù)測(cè)定，連續(xù)檢測(cè)5～10 d，得到低濃度標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（s低值）。

3.2樣本量的選擇

評(píng)估程序中，空白標(biāo)本數(shù)量和低值標(biāo)本數(shù)量的最佳比例的選擇取決于LoB估計(jì)值（LoB估計(jì)）和低值標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的離散度估計(jì)的不確定性。統(tǒng)計(jì)學(xué)上非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法的效率要低于參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，其檢驗(yàn)效率只有參數(shù)統(tǒng)計(jì)的一半左右，因此用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的方法計(jì)算P95·空白時(shí)，建議空白標(biāo)本的數(shù)量應(yīng)該大于低值標(biāo)本的數(shù)量。但低值標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的離散程度（s低值）要明顯大于空白標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的離散程度（s空白）。因此綜合以上兩個(gè)因素，建議空白標(biāo)本和低值標(biāo)本的檢測(cè)次數(shù)一樣或至少接近[8]。而且理論上通過(guò)增加空白標(biāo)本和低值標(biāo)本的重復(fù)檢測(cè)次數(shù)可以擴(kuò)大樣本量，減少抽樣誤差，使樣本更好地反映總體。但實(shí)際工作中不可能對(duì)標(biāo)本進(jìn)行無(wú)限次重復(fù)檢測(cè)，一般要求做20次或20次以上的重復(fù)測(cè)定，降低P95·空白和s低值來(lái)分別估計(jì)LoB和σs所帶來(lái)的不確定性。

3.3 LoB和LoD的評(píng)估

由于是從有限例數(shù)的樣本信息中推斷總體特征，因此在LoD的評(píng)估過(guò)程中還要考慮到估值的不確定性，LoD估計(jì)的不確定性由LoB估計(jì)和s低值的不確定性共同構(gòu)成。空白標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)次數(shù)（nB）不同，LoB的95%的可信限（Confidence Interval，CI）也不同，當(dāng)50≤nB≤300時(shí)，可通過(guò)LoB的可信限界值表來(lái)查得LoB的80%和95%的可信限[10]。例如當(dāng)nB=50，LoB有95%的概率落入第（n-5）位數(shù)到第n位數(shù)這一區(qū)間內(nèi)（所有的檢測(cè)結(jié)果按照從小到大順序排列）。s低值估值80%和95%的可信限的界限值通過(guò)其公差因數(shù)表查得。

在實(shí)際的評(píng)估過(guò)程中，我們只能根據(jù)已有的資料或經(jīng)驗(yàn)粗略地估計(jì)LoD可能的存在范圍，配置該濃度水平的低值標(biāo)本并重復(fù)測(cè)定，根據(jù)該濃度水平下檢測(cè)結(jié)果的s低值來(lái)計(jì)算LoD估計(jì)。Linnet[8]認(rèn)為：對(duì)于含有不同待測(cè)物水平的低值標(biāo)本，其檢測(cè)結(jié)果的離散程度有差異，隨著標(biāo)本濃度的增加，檢測(cè)結(jié)果的離散度同時(shí)增加。但兩個(gè)低值標(biāo)本的待測(cè)物濃度相差較小時(shí)，兩組檢測(cè)結(jié)果的離散度可認(rèn)為是相當(dāng)?shù)摹Ｒ虼颂幚沓绦蚓拖鄬?duì)簡(jiǎn)單，否則還要將標(biāo)準(zhǔn)偏差考慮成一個(gè)隨樣本濃度變化而變化的函數(shù)，那將會(huì)是一個(gè)非常復(fù)雜的處理程序。

3.4 LoD估計(jì)或LoD理論的驗(yàn)證

根據(jù)以上點(diǎn)估計(jì)的方法得到的LoD估計(jì)難以和LoD真值完全一致，因此必須對(duì)LoD估計(jì)的有效性進(jìn)行檢驗(yàn)。此外，很多實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有條件可能難以建立一個(gè)適合本實(shí)驗(yàn)室使用的LoD，那么就要對(duì)制造商提供的理論LoD（LoD理論）進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)其是否適用于本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)體系。一套完整的LoD估計(jì)或LoD理論驗(yàn)證程序包括：①對(duì)一份或多份空白標(biāo)本進(jìn)行nB次重復(fù)檢測(cè)后，計(jì)算P95·空白，作為本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系的LoB估計(jì)；②在空白標(biāo)本中加入標(biāo)準(zhǔn)品，使標(biāo)本中的待測(cè)物濃度達(dá)到LoD估計(jì)或LoD理論水平，觀察檢測(cè)結(jié)果中大于LoB估計(jì)的部分在所有檢測(cè)結(jié)果中所占的比例（P），P≥95%時(shí)認(rèn)為L(zhǎng)oD估計(jì)或LoD理論是有效的。考慮到以樣本代替總體時(shí)，會(huì)發(fā)生抽樣誤差，因此對(duì)于n<1000的樣本，即使LoD估計(jì)或LoD理論有效，P值也可能低于95%。所以Linnet[8]在假設(shè)α=β=0.05、σs/σB=1.5、n=nB=nS的前提下，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理進(jìn)行模擬分析，得出不同樣本量的情況下，對(duì)待測(cè)物濃度為L(zhǎng)oD估計(jì)或LoD理論水平的最低濃度標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果中要求大于LoB的比例。對(duì)于樣本量在20～1 000之間的樣本，我們可以通過(guò)查詢要有多少相應(yīng)比例的檢測(cè)結(jié)果分布在指定區(qū)間內(nèi)。對(duì)于完整檢驗(yàn)程序來(lái)說(shuō)，由于LoB是一個(gè)自變量，所以這一比例可以適度放寬。

3.5結(jié)果的報(bào)告

LoB的取值直接反映醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，關(guān)系到患者結(jié)果如何報(bào)告臨床，是報(bào)告“檢測(cè)到某物質(zhì)”還是報(bào)告“未檢出某物質(zhì)”，這對(duì)臨床來(lái)說(shuō)應(yīng)該是一個(gè)非常明確的提示。如果報(bào)告“未檢出某物質(zhì)”，那說(shuō)明某物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果低于LoB水平，這意味著標(biāo)本中該物質(zhì)的真實(shí)水平“可能”要低于LoD。為什么是“可能”呢？因?yàn)槲覀冞€要考慮到統(tǒng)計(jì)學(xué)的Ⅱ類錯(cuò)誤（即β類錯(cuò)誤）的發(fā)生，盡管其發(fā)生的概率往往被限制在5%以內(nèi)。因此，對(duì)于一個(gè)低于LoB水平的檢測(cè)結(jié)果，我們只能夠報(bào)告“低于LoD水平”而不能夠報(bào)告“低于LoB水平”或是“0”。對(duì)于一個(gè)大于LoB的結(jié)果，這意味著其濃度大于0，一般報(bào)告”>0”或者“檢到某物質(zhì)”，因?yàn)檫@樣我們可以避開(kāi)統(tǒng)計(jì)學(xué)I類錯(cuò)誤（α類錯(cuò)誤）的發(fā)生，盡管發(fā)生此類錯(cuò)誤的概率低于5%。

對(duì)于待測(cè)物水平等于或略高于LoD的標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，其相對(duì)不確定度往往會(huì)很大，一般來(lái)說(shuō)這種數(shù)據(jù)不應(yīng)直接報(bào)告給臨床。對(duì)于每個(gè)定量檢測(cè)的項(xiàng)目還應(yīng)該設(shè)立其相應(yīng)的定量限 （Limit of Quantitation，LoQ），以規(guī)范定量檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告，這一界限值（LoQ）和實(shí)驗(yàn)室能接受的相對(duì)不精密度（CV）有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)程和文件中，每個(gè)項(xiàng)目的LoQ都應(yīng)明確規(guī)定，例如在CV為10%或20%時(shí)，各自對(duì)應(yīng)的LoQ是多少。應(yīng)該充分考慮在這一濃度水平的檢測(cè)結(jié)果可能存在的偏倚，以便計(jì)算出其相應(yīng)的LoQ，使定量檢測(cè)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果能夠準(zhǔn)確報(bào)告。為了保證檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告的科學(xué)性，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果≤LoB時(shí)，可報(bào)告“未檢出待測(cè)物”或“待測(cè)物濃度

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（收稿日期：2012-05-07）