山東省2011年春季中標禽流感滅活疫苗質量檢測及抗體消長規律分析

摘 要：為了摸清山東省高致病性禽流感疫苗的質量情況，對2011年春季山東省3個中標廠家生產的重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）進行了質量檢驗和疫苗的抗體消長規律的跟蹤。試驗結果顯示：除L廠家的2011010批次、G廠家的2011012批次有菌外，3個廠家的其余33批次滅活疫苗的物理性狀、滅活檢驗和無菌檢驗均全部合格。免疫SPF雞3周后，除Q廠家2011005批次疫苗外，其余34批疫苗HI抗體效價均≥60log2，產品達到質量標準要求。抗體消長規律實驗表明，3個廠家的疫苗免疫SPF雞4周即可達到高峰值， Re-4 HI抗體水平≥95log2， Re-5 HI抗體水平≥80log2，至25周時，仍維持在高抗體水平：Re-4 HI 抗體水平≥90log2， Re-5 HI 抗體水平≥78log2。從總的趨勢看，L廠家的疫苗免疫抗體效價好于Q廠家和G廠家。

關鍵詞：禽流感滅活疫苗；質量檢測；抗體消長規律

中圖分類號：S852.5+2（252） 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0089-04

Antibody Response Dynamics and Quality Inspection of

Inactivated Avian Influenza Vaccines from

Shandong Government Tender in the Spring of 2011

Ai Wu， Qi LiHong， Wang ChunLing， Xu HuaiYing， Liu Tao， Li Feng， Yang YingGe， Wang LiLi*

（Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory

of Diagnosis and Immunity of Poultry Diseases of Shandong Province， Jinan 250023， China）

Abstract To inspect the quality of highly pathogenic avian influenza vaccines in Shandong province， the antibody response dynamics and the quality of bivalent inactivated avian Influenza vaccines of H5N1 subtype （strain Re-5+Re-4） from Shandong Government Tender was analyzed in this paper. The results showed that 33 batches inactivated vaccines from three manufacturers were qualified in physical properties， inactivation test， and sterility test except batch 2011010 from L manufacturer and batch 2011012 from G manufacturer. Three weeks after the first immunization， the antibody titers of the tested chickens were all over 6.0log2 except batch 2011005 from Q manufacturer. The antibody response dynamics test showed that all the HI titers stimulated by the vaccines from the three manufacturers could reach to the peak after 4 weeks from the first immunization，and the HI titers against Re-4 were higher than 9.5log2，while that against Re-5 were higher than 8.0log2. The antibody level against Re-4 and Re-5 remained high after 25 weeks， and the titers against Re-4 and Re-5 were higher than 9.0log2 and 7.8log2， respectively. It was found that the immune antibody titers stimulated with the products from L manufacturer were better than that of Q or G manufacturer.

Key words Avian influenza inactivated vaccine； Quality inspection； Antibody response dynamics

高致病性禽流感由A型流感病毒引起，主要發生于禽類呼吸系統，導致產蛋下降乃至急性致死和高死亡率的烈性傳染病，世界動物衛生組織目前將其歸為通報性高致病性禽流感，我國《動物防疫法》將其列為一類疫病[1，2]。2004年1月28日，我國政府對外公布了H5N1亞型高致病性禽流感病毒的疫情。高致病性禽流感的暴發流行，嚴重影響了養禽業的發展，給養禽業帶來沉重的打擊，并造成巨大的經濟損失[3]。特別是H5N1亞型高致病性禽流感病毒能直接感染人并能導致死亡，引起了全世界的廣泛關注。

為了有效預防和迅速控制H5亞型高致病性禽流感疫情，許多國家和地區采取了以撲殺、強制性免疫和生物安全相結合的撲滅措施，取得了良好的效果，世界衛生組織專家也建議免疫接種可作為撲殺的補充手段[3]。2004年我國規定對高致病性禽流感實行強制免疫，接種的疫苗實行政府招標。為了摸清山東省高致病性禽流感疫苗的質量情況，確保招標疫苗的免疫效果。本試驗對2011年山東省3個中標廠家生產的重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）產品進行了質量檢驗和疫苗的抗體消長規律的跟蹤。

1 材料與方法

11 供試材料

111 疫苗 來自3個中標廠家的重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株），廠家名稱分別用L、Q和G表示。具體批次見表1。

112 試驗雞 40日齡SPF雞，由山東昊泰實驗動物繁育有限公司提供。

113 禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原 青島易邦生物工程有限廠家生產，山東省動物疫病預防與控制中心惠贈。Re-5血凝抑制試驗診斷抗原批號20110507，Re-4血凝抑制試驗診斷抗原批號20110510。

114 試驗地點 山東省農業科學院家禽研究所。

12 試驗方法

121 抽樣 根據《獸用生物制品批簽發管理程序》規定，滅活疫苗每批次疫苗抽樣10瓶，取其中5瓶進行檢驗，其余的5瓶存檔。

122 物理性狀檢驗 依照《中華人民共和國獸藥典三部 2010年版》第13～14頁規定方法，進行外觀、劑型、穩定性及粘度檢驗。

123 無菌檢驗 每瓶滅活疫苗無菌操作取1 ml疫苗，加入到50 ml硫乙醇酸鹽培養基中增菌3天，然后再接種2支硫乙醇酸鹽（TG）小管、2支酪胨瓊脂（GA）斜面和1支葡萄糖蛋白胨湯（GP）小管，觀察5天。

124 滅活檢驗 待檢各批次樣品經尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚10個，每胚接種02 ml，置36～37℃繼續孵育，棄去24 h死亡雞胚，觀察至120 h，雞胚非特異性死亡均不超過2個，檢測雞胚液的HA效價。

125 安全檢驗 每瓶疫苗用40日齡SPF雞10只，各頸部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，觀察14日。

126 效力檢驗 每個廠家的每批疫苗各取5瓶，每瓶疫苗用40日齡SPF雞10只，各頸部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同時另設5只作對照。免疫后3周，每只雞分別采血，分離血清，分別用Re-4和Re-5血凝抑制試驗診斷抗原，測定HI抗體效價。

127 抗體消長規律的檢測 每瓶疫苗用40日齡SPF雞10只，每只各頸部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同時另設5只作對照。免疫后每周采血，分離血清，測定HI抗體效價，計算每批疫苗的幾何平均指數，連續進行25周，分析抗體消長規律。

2 結果與分析

21 物理性狀檢驗結果

211 外觀 各樣品均為白色乳劑。

212 劑型 取一清潔吸管，吸取少量待檢成品滴于冷水中，各樣品均呈油滴狀，不擴散，為油包水型。

213 穩定性 各樣品經離心檢驗均無分層現象。

214 粘度 各批次每個樣品流出04 ml所需的時間均在8 s以內，符合規程標準。

22 無菌檢驗

除L廠家的2011010批次樣品、G廠家的2011012批次產品在TG、GA和GP培養基上有細菌生長外，其余均未見細菌生長。

23 滅活檢驗

各批次樣品均為陰性。

24 安全檢驗

觀察14日，接種2羽份各批次樣品的雞只無全身反應，注射部位吸收較好，無眼觀病變。

25 效力檢驗

各批次疫苗樣品接種試驗雞3周后，采血檢測抗體效價，對照雞幾何平均效價均低于2log2，免疫雞HI抗體幾何平均效價Re-4在975log2～1077log2之間， Re-5在796log2～895log2之間（詳見表2）。

用L廠家的重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）免疫3周后Re-4抗體水平≥6log2比例達9947%，且Re-4 HI效價≥10log2的占89%；Re-5水平合格率達9857%，Re-5 HI效價≥9log2的占8065%（詳見表3）。

用Q廠家疫苗免疫3周后Re-4 抗體水平≤5log2的占27%，合格率占973%，Re-5 HI效價≤5log2的占774%，合格率占9226%（詳見表4）。造成不合格的主要原因是2011005批次疫苗檢驗的5瓶中有2瓶幾何平均效價低于6的緣故，將這兩瓶復檢，結果同樣是不合格。

用G廠家疫苗免疫3周后Re-4 HI抗體水平≤5log2的占511%，Re-4 HI抗體水平在6log2 ～9log2之間的占2847%，Re-4 HI效價≥10log2的占6569%，其中效價為10log2的最多占3066%，效價≥12log2的占803%；Re-5 HI效價≤5log2的占962%，6log2～8log2 之間的占5186%，Re-5 HI效價≥9log2的占3852%，其中效價為8log2的最多，占3111%， HI效價≥11log2的為0（見表5）。

26 抗體消長規律 疫苗免疫前及免疫后每周進行監測，觀察禽流感Re-4 和Re-5的HI抗體效價，1～25周抗體詳細結果見圖1和圖2。

SPF雞免疫后第1周，3種疫苗免疫雞的平均HI抗體均≤3log2，第2周除免疫Q廠家疫苗Re-5平均HI抗體≤6log2外，其余均≥6log2。三家禽流感二價苗免疫4周即可達到高峰值，免疫L廠家疫苗的Re-4可達到1090log2，Re-5可達到950log2，免疫Q廠家疫苗的Re-4可達到1010log2，Re-5可達到860log2，免疫G廠家疫苗的Re-4可達到975log2，Re-5可達到800log2，維持至25周后抗體水平逐漸下降，但仍≥8log2。從總的趨勢看，免疫L廠家疫苗的抗體水平高于其他兩家。免疫Q廠家和G廠家抗體水平相當。

3 小結與討論

31 通過對3個廠家的35批次的重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）物理性狀全部合格。L廠家的批次為2011010、G廠家的批次為2011012在TG、GA和GP培養基上長菌外，其余均無菌。滅活檢驗全部合格。通過頸部皮下接種5周齡SPF雞，每只2羽份，觀察2周雞只無不良反應，剖檢試驗雞只，注射部位均吸收良好，證實疫苗是安全的。免疫效力試驗結果表明，3家中標單位疫苗，免疫3周后，除Q廠家的批次為2011005的疫苗外，其余34批疫苗的Re-5 和Re-4 HI抗體效價均高于6log2，產品均達到質量標準要求。

32 比較3個廠家疫苗免疫3周后 HI抗體效價平均值可知，三廠家的Re-4抗體均比Re-5的水平高，L廠家Re-4抗體平均值比Re-5的水平高182log2，Q廠家Re-4抗體平均值比Re-5的水平高138log2，G廠家Re-4抗體平均值比Re-5的水平高179log2。

33 對3個廠家疫苗免疫3周后不同抗體水平的分布情況表和分布圖分析可見：L廠家的免疫合格率最高，Q廠家的次之，最低的是G廠家。高抗體滴度所占比例也是L廠家的最高，Q廠家的Re-4低于G廠家，但就Re-5而言，Q廠家高抗體所占比例高于G廠家，且G廠家HI抗體效價沒有達到11log2和12log2的。同時也能看出抗體L廠家的整齊度均高于其他兩廠家。

34 從SPF雞抗體消長規律可知， SPF雞免疫后3周，免疫三家疫苗的HI抗體均≥796log2，4周即可達到高峰值，至25周時，仍維持在高抗體水平維持，Re-4抗體水平≥9log2， Re-5抗體水平≥779log2，同一家的疫苗Re-4抗體水平比Re-5抗體水平約高1個滴度。從總的趨勢看，免疫L廠家疫苗的抗體水平高于其他兩家，Q廠家和G廠家抗體水平相當。Re-4的抗體水平G廠家稍好于Q廠家，但Re-5的抗體水平Q廠家略高于G廠家（抗體消長規律試驗仍在進行中）。

35 自2004年，我國政府對外公布了H5N1亞型高致病性禽流感病毒的疫情以來，規定對高致病性禽流感實行強制免疫，取得了一定的成效，但還存在各種各樣的問題。長期以來，對招標禽流感疫苗的質量問題存在眾多疑問。但從本試驗對山東省35個批次的中標重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）質量檢測結果顯示，除1個批次疫苗外，免疫效果確實，免疫維持期較長，均達到或超過質量標準規定的要求。參 考 文 獻：

[1] 甘孟侯禽流感（第2版）[M]北京：中國農業出版社， 2002

[2] 于康震 禽流感防控啟示錄[A]中國畜牧獸醫學會禽病學分會第十四次學術研討會論文集 [C]揚州：中國畜牧獸醫學會禽病學分會編，2008

[3] 李明義，白志娟，宮 曉，等 禽流感H5亞型油乳劑滅活疫苗抗體消長規律的研究[J] 上海畜牧獸醫通訊，2004，5：6-7 山 東 農 業 科 學 2012，44（12）：93～96，99