三個新的大白菜CBL基因的鑒定和特征分析

摘 要：利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸數據庫中重新搜索比對大白菜的基因組序列，鑒定出3個新的大白菜CBL基因，并對這3個基因的結構、遺傳進化和順式元件進行了分析，為進一步克隆和研究這些基因的功能提供了有益借鑒。

關鍵詞：大白菜；CBL基因；基因結構；遺傳進化；順式元件

中圖分類號：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0007-04

Identification and Characteristics Analysis of Three Novel

CBL Genes from Chinese Cabbage

Zhang YongTao1， Liu LiFeng2， Li HuaYin2， Zhang YiHui2， Wang HuanQin3，

Wang FengDe2， Gao JianWei2， Li LiBin2*

（1.Institute of Vegetables， Linyi Academy of Agricultural Sciences， Linyi 276012， China；

2.Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory for Biology of

Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center， Jinan 250100， China；

3.Leling Agricultural Bureau， Leling 253600， China）

Abstract Three novel CBL genes were indentified from Chinese cabbage by using the known CBL genes of Chinese cabbage as queries to blast the Chinese genome sequences in public nuclear acid databases. The structure， phylogeny and cis-elements of these genes were analyzed. This study provided valuable information for further cloning and functional analysis of these novel CBL genes.

Key words Chinese cabbage； CBL genes； Gene structure； Phylogeny；Cis-elements

近年來研究表明，植物中一類與鈣結合的蛋白（類鈣調磷酸酶B亞基蛋白，Calcineurin-B like protein）基因CBL家族在植物應答干旱、鹽堿、低溫脅迫、礦質營養吸收、ABA以及鈣信號轉導過程中具有重要功能[2，5，10，13，15，17]，CBL蛋白主要是作為鈣感受器與一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CIPK）互作來調控下游基因的表達，以響應各種不同的逆境和激素信號[2，4]。例如，在擬南芥中CBL4（SOS3）和CBL10蛋白可以和CIPK24（SOS2）結合，調控下游基因SOS1（鈉離子/質子-反向運輸的載體）的表達，促進細胞中鈉離子的排出，從而提高植物對鹽脅迫的抗性[2，11，16]。又如，在擬南芥中CBL1和CBL9與CIPK23結合，調控下游基因AKT1的表達，從而促進鉀離子的吸收[7，17]。另外，AtCBL2和CIPK11結合可以調控擬南芥對堿（高pH）的抗性[8]；擬南芥AtCBL1、2、3、5、10基因在干旱、鹽脅迫和ABA信號應答過程中具有重要功能[4，9，12，14，16]。在水稻、玉米等農作物中也有研究[3，8，9，11]，但在我國重要蔬菜作物中缺乏系統研究。在以往的研究中，本文作者通過生物信息學分析，從大白菜基因組中鑒定出13個CBL基因，并對它們的遺傳進化進行了分析[1]。在此基礎上，作者利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸數據庫中重新搜索比對大白菜的基因組序列，鑒定出3個新的大白菜CBL基因，并對這3個基因的結構、遺傳進化和順式元件進行了分析，為進一步克隆和研究這些基因的功能奠定了基礎。

1 研究方法

利用大白菜已知CBL基因序列在GenBank中重新搜索比對大白菜的基因組序列 （http：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi），尋找新的大白菜CBL基因序列，對鑒定出的CBL新基因進行結構分析和遺傳進化分析，并對它們啟動子序列中的順式元件進行預測。結構分析利用GSDS（http：//gsdscbipkueducn/）在線進行，遺傳進化分析利用MEGA41進行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining 方法，重復500次運算，順式元件預測采用PlantCARE軟件進行在線分析。亞細胞定位預測在WoLF PSORT （http：//wolfpsortorg/） 中進行。

2 結果與分析

21 大白菜3個新CBL基因的鑒定和結構特征分析

利用已知的大白菜CBL基因序列，在GenBank中重新搜索和比對，發現了3個新的大白菜CBL基因，分別位于大白菜A01和A10染色體上的BAC AC2347501、CU6953051和FP325321中，它們在大白菜基因組數據庫BRAD中對應的基因位點分別為Bra002301、Bra026421和Bra011404。在BRAD中，Bra002301解析的編碼區為333 bp，不僅與我們的結果大不相同，與擬南芥等物種中的CBL編碼區大小也相差甚遠。據此認為，Bra002301的解析結果可能不正確， 而BRAD中Bra011404的解析結果與本文一致。Bra026421的編碼區為657 bp，與本文的解析結果相近。另外，本文還發現，CU6953051中的CBL基因可能存在可變剪切，預測編碼區大小還有822 bp和762 bp兩種形式。這3個新基因基因組序列中內含子的數目分別為7和6，外顯子-內含子結構如圖1所示。它們預測編碼的蛋白可能分別定位到細胞核、細胞質和葉綠體中（見表1），顯示在功能上可能有所不同。

注：方框代表外顯子，線代表內含子。

圖1 大白菜3個新CBL基因的外顯子-內含子結構

22 大白菜3個新CBL基因的進化分析

這3個新的大白菜CBL基因與擬南芥和已知13個大白菜CBL基因的系統進化關系如圖2所示。AC2347501與AtCBL5直系同源；FP325321與BrCBL10關系最近，為姊妹對基因，并分別與AtCBL10直系同源；CU6953051與BrCBL3為姊妹對基因，和AtCBL2在一個類群中。現有研究表明，AtCBL2在高pH抗性和ABA應答中具有重要功能[7，17]，AtCBL5的過表達可以增強植物對干旱和滲透脅迫的抗性[18]，而AtCBL10在植物鹽脅迫應答過程中具有重要功能[15]。因此，本文推測大白菜AC2347501在滲透脅迫應答過程中具有一定功能，CU6953051可能參與高pH抗性和ABA應答過程，而FP325321可能參與鹽脅迫應答過程。23 大白菜新CBL基因的順式調控元件

為了研究大白菜新CBL基因的功能和表達模式，我們對其啟動子及其上游序列中的順式反應元件進行了分析和預測。結果表明，大白菜新CBL基因擁有多種逆境和激素應答元件，且各不相同。這3個新基因都含有干旱應答元件MBS和逆境與病原物應答元件TC-rich 重復序列，而且只有FP325121含有脫落酸響應元件ABRE、赤霉素響應元件GARE、生長素應答元件TGA、水楊酸應答元件TCA和冷脅迫應答元件LTR，沒有茉莉酸甲酯響應元件CGTCA和熱脅迫應答元件HSE，此外，它還有乙烯應答元件ERE；CU6953051

圖2 大白菜與擬南芥CBL基因的進化分析

含有的順式元件較少，除MBS和TC-rich序列外，還含有一個茉莉酸甲酯響應元件CGTCA；而AC2347501還有乙烯應答元件ERE、茉莉酸甲酯響應元件CGTCA、熱脅迫應答元件HSE。這說明這3個基因在激素和逆境響應過程中的功能有所不同，FP325321可響應多種激素信號以及干旱、溫度和病原物脅迫，而CU6953051 可能響應茉莉酸甲酯信號和干旱及病原物脅迫，AC2347501可響應乙烯和茉莉酸甲酯信號以及熱脅迫、干旱脅迫及病原物脅迫。

3 結論

通過基因組數據深入挖掘，從大白菜基因組中鑒定出3個新的CBL基因，序列分析和遺傳進化分析發現這3個新基因確實與已知的13個大白菜CBL基因不同。至此，我們已發現在大白菜基因組中至少存在著16個CBL基因。順式調控元件分析顯示，這3個新的大白菜CBL基因的上游序列中含有的激素和逆境應答元件各不相同，說明它們在功能上可能有所不同。根據遺傳進化分析的結果和已知擬南芥相應基因的功能，推測大白菜AC2347501在滲透脅迫應答過程中具有一定功能，CU6953051可能參與高pH抗性和ABA應答過程，而FP325321可能參與鹽脅迫應答過程。至于它們實際功能如何，還需要實驗進一步驗證。本文為進一步克隆和研究這3個大白菜新的CBL基因的功能奠定了基礎。參 考 文 獻：

[1] 李利斌，王殿峰，劉立鋒，等大白菜CBL家族基因的鑒定和遺傳進化分析[J]山東農業科學，2009，5：4-7

[2] 張俊文， 魏建華，王宏芝，等CBL-CIPK信號系統在植物應答逆境脅迫中的作用與機制[J] 自然科學進展， 2008， 18（18）： 847-856

[3] 李利斌，劉開昌，王殿峰，等玉米CBL家族基因的生物信息學分析[J] 玉米科學，2010， 18（1）： 6-11

[4] Batistic O， Kudla J Plant calcineurin B-like proteins and their interacting protein kinases[J] Biochim Biophys Acta， 2009， 1793（6）：985-992

[5] Cheong Y H， Kim K N， Pandey G K，et al CBL1， a calcium sensor that differentially regulates salt， drought， and cold responses in Arabidopsis[J] The Plant Cell，2003，15：1833-1845

[6] Cheong Y H， Pandey G K， Grant J J， et al Two calcineurin B-like calcium sensors， interacting with protein kinase CIPK23， regulate leaf transpiration and root potassium uptake in Arabidopsis [J] The Plant Journal， 2007， 52（2）： 223-239

[7] Fuglsang A T， Guo Y， Cuin T A， et al Arabidopsis protein kinase PKS5 inhibits the plasma membrane H1-ATPase by preventing interaction with 14-3-3 protein [J] The Plant Cell， 2007， 19： 1617-1634

[8] Gu Z， Ma B， Jiang Y，et al Expression analysis of the calcineurin B-like gene family in rice （Oryza sativa L） under environmental stresses[J] Gene， 2008， 415（1-2）：1-12

[9] Hwang Y S， Bethke P C， Cheong Y H， et al A gibberellin-regulated calcineurin B in rice localizes to the tonoplast and is implicated in vacuole function [J] Plant Physiology， 2005， 138（3）： 1347-1358

[10] Kim B G， Waadt R， Cheong Y H， et al The calcium sensor CBL10 mediates salt tolerance by regulating ion homeostasis in Arabidopsis[J] The Plant Journal， 2007， 52（3）： 473-484

[11] Kolukisaoglu U， Weinl S， Blazevic D et al Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks[J] Plant Physiology， 2004，134（1）： 43-58

[12] Martínez-Atienza J， Jiang X， Garciadeblas B，et al Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice [J] Plant Physiology， 2007， 143（2）： 1001-1012

[13] Oh S， Park J， Yoon S， et al CBL3 modulates the Arabidopsis MTAN enzyme activity[J] Plant Physiology， 2008，148（4）：1883-1896

[14] Pandey G K， Cheong Y H， Kim K， et al The calcium sensor calcineurin B-Like 9 modulates abscisic acid sensitivity and biosynthesis in Arabidopsis[J] The Plant Cell， 2004， 16（7）： 1912-1924

[15] Quan R， Lin H， Mendoza I， et al SCABP8/CBL10， a putative calcium sensor， interacts with the protein kinase SOS2 to protect Arabidopsis shoots from salt stress[J] The Plant Cell， 2007，19（4）： 1415-1431

[16] Xu J， Li H D， Chen L Q， et al A protein kinase， interacting with two calcineurin B-like proteins， regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis[J] Cell， 2006，125（7）：1347-1360

[17] Batisticˇ O， Rehers M， Akerman A， et al S-acylation-dependent association of the calcium sensor CBL2 with the vacuolar membrane is essential for proper abscisic acid responses[J] Cell Res， 2012，22（7）：1155-1168

[18] Cheong Y H， Sung S J， Kim B G， et al Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5 confers osmotic or drought stress tolerance in Arabidopsis [J] Molecules and Cells， 2010，29（2）：159-165