和田維吾爾族長(zhǎng)壽老人腸道益生乳酸菌的分離鑒定

摘 要:【目的】從和田維吾爾族長(zhǎng)壽老人糞便中篩選并鑒定定植腸道的益生乳酸菌，通過(guò)數(shù)量和種類(lèi)與一般人進(jìn)行比較，為后續(xù)篩選高抑菌活性，具有降膽固醇功能的菌株提供基礎(chǔ)。【方法】首先用微生物平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)糞便中的細(xì)菌總數(shù)，然后用改良的MRS+CaCO3固體培養(yǎng)基篩選乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定，挑選出18株長(zhǎng)壽老人源腸道乳酸菌和9株一般人源腸道乳酸菌，并進(jìn)行16S rDNA序列鑒定。【結(jié)果】從和田長(zhǎng)壽老人糞便中分離得到乳酸菌18株，其中8株屬于植物乳桿菌，10株屬于腸球菌，一般人糞便中分離得到乳酸菌9株，都屬于腸球菌。長(zhǎng)壽老人腸道中腸球菌占優(yōu)勢(shì)，但是一般人腸道中沒(méi)有植物乳桿菌，只有腸球菌。【結(jié)論】經(jīng)形態(tài)學(xué)，生理生化，分子鑒定等方法從和田長(zhǎng)壽老人腸道中分離出的27株乳酸菌屬于腸球菌和植物乳桿菌的不同變異品系，為進(jìn)一步研究抑菌活性，降膽固醇功能，安全性并益生菌與長(zhǎng)壽的關(guān)系奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:和田 長(zhǎng)壽老人 乳酸菌 分離與鑒定

中圖分類(lèi)號(hào):Q文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1674-098X(2012)03(a)-0228-03

乳酸菌是人體腸道內(nèi)重要的生理性有益菌，具有維持胃腸道正常的微生態(tài)平衡、抑制病原菌的入侵和感染以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理作用。

新疆和田地區(qū)是世界五大長(zhǎng)壽區(qū)之一，我國(guó)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家曾對(duì)我國(guó)著名的長(zhǎng)壽地區(qū)進(jìn)行多次調(diào)查和研究，總結(jié)了基因和自然環(huán)境因素的影響等兩個(gè)方面是百歲老人長(zhǎng)壽的原因。他們研究中的環(huán)境因素主要局限于群體的居住環(huán)境、食物構(gòu)成、空氣、水質(zhì)等等，而長(zhǎng)期忽略了一個(gè)非常重要的因素—人類(lèi)共生微生物。人類(lèi)共生微生物是構(gòu)成人體的一個(gè)不可缺少的部分:人類(lèi)自身的細(xì)胞總數(shù)大約有60兆個(gè)，而健康人自身攜帶的共生微生物的數(shù)量可以達(dá)到1000兆以上，即大于人體自身細(xì)胞數(shù)的100倍。這個(gè)數(shù)量級(jí)的生物并不是人類(lèi)的身外之物，而是與人類(lèi)共生共存，成為互相依存的共生體。人類(lèi)的消化系統(tǒng)、皮膚表面從里到外都分布滿了各種微生物，他們決定人體的消化、免疫、代謝，人類(lèi)的生存質(zhì)量，甚至左右人類(lèi)的情緒。研究發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌對(duì)人體有降膽固醇、降血壓和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種保健功能。

本研究首次我國(guó)和田地區(qū)90歲以上維吾爾族長(zhǎng)壽老人糞便為實(shí)驗(yàn)材料，一般人和長(zhǎng)壽老人的后代嬰兒糞便作為對(duì)照組，按傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)分離出27株乳酸菌，并通過(guò)16Sr DNA序列分析方法準(zhǔn)確地對(duì)該

菌株進(jìn)行種屬歸類(lèi)，為進(jìn)一步研究乳酸菌的益生功能，以便探討腸道益生菌與長(zhǎng)壽的關(guān)系奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的來(lái)源

從新疆和田墨玉縣采取的長(zhǎng)壽老人及其對(duì)照組(一般人和長(zhǎng)壽老人的后代嬰兒)的糞便做實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良的MRS固體培養(yǎng)基:用于乳酸菌的分離純化。

MRS半固體培養(yǎng)基:觀察乳酸菌的運(yùn)動(dòng)性。

MRS液體培養(yǎng)基:用于乳酸菌的活化與理化鑒定。

明膠培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨瓊脂柱培養(yǎng)基(H2S試驗(yàn))、蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚實(shí)驗(yàn))、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基:用于生理生化鑒定。

1.1.3 藥品

藥品均為市售分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋:上海博迅公司;GXZ型智能光照培養(yǎng)箱:寧波江南儀器廠;722s分光光度計(jì)752C:上海第三分析儀器廠;奧特光學(xué)BK系列生物顯微鏡:重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;JD200-3型電子天平:沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;SWCJ-1F型超凈工作臺(tái):江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;哈納酸度離子計(jì)pH211:北京哈納科儀科技有限公司;

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

稱取1.0g樣品，加入到裝有9.0ml無(wú)菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-44個(gè)稀釋度。用經(jīng)滅菌并冷卻到45℃～50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基傾倒平板，37℃培養(yǎng)48h，放在37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩天后觀察并記錄細(xì)菌數(shù)目。

1.2.2 乳酸菌的分離

稱取1.0g樣品，加入到裝有9.0ml無(wú)菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-44個(gè)稀釋度。用經(jīng)滅菌并冷卻到45～50℃的含有CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基傾倒平板，上面覆蓋一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)48h，挑取淺藍(lán)色的，有溶鈣圈的菌落，轉(zhuǎn)移到MRS平板上，直到得到單菌落為止。每一個(gè)單菌落接一個(gè)裝有5mlMRS液體培養(yǎng)基的試管，上面導(dǎo)入一層已滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)48h。

1.2.3 乳酸菌的初步鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定:對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，進(jìn)行革蘭氏染色。

(2)生理生化鑒定:對(duì)篩選的革蘭氏陽(yáng)性菌菌株分別進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在pH 4.5，溫度15℃、45℃，6.5％ NaCl下的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 16S rDNA序列鑒定

對(duì)被選的27株乳酸菌菌株進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，DNA提取方法參照參考文獻(xiàn)。

將提取所得的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用正向引物27f:5，-AGAGTTT GATCC

TGGCTCAG-3，反向引物1492R:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR反應(yīng)體系(25μL):引物(10μmol/L):各引物1μL;10×PCR Buffer:2.5μL;dNTP mix:2μL;Taq 酶:0.3μL;模板:1μL;超純水補(bǔ)足至25μL。

PCR反應(yīng)條件為:94℃4min，94℃ 30s，54℃ 30min，72℃ 2min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物3μL，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳液為0.5×TBE。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定(如表1)

從表可以看出，長(zhǎng)壽老人腸道中益生菌的數(shù)量比一般人腸道中的多。

2.2 菌株的分離、純化

通過(guò)以上的方法已分離到乳酸菌27株。

2.3 乳酸菌初步鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定:

a:菌落觀察:菌落皆為淺藍(lán)色或乳白色，圓形，形成鈣溶圈，直徑約為1-3mm。

b:革蘭氏染色:27株菌是球菌和桿菌，革蘭氏陽(yáng)性菌，或叢生、或?qū)ι?/p>

(2)菌類(lèi)鑒定:篩選得到27株菌皆符合乳酸菌的性質(zhì):革蘭氏陽(yáng)性菌，接觸酶陰性。乳酸菌的鑒定結(jié)果如表2、表3所示:

備注:“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性;

Note:“+”means positive reaction，- means negative reaction

從表1，表2可以看出，已分離的27株乳酸菌均為革蘭氏染色陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，在H2O2酶實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)呈陰性，都能在15℃，45℃，pH4.5，6.5％ NaCl生長(zhǎng)良好，不發(fā)酵蔗糖和木糖，能發(fā)酵葡萄糖和乳糖。

2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

16SrDNA基因序列在Eztaxon server 2.1中進(jìn)行序列比對(duì)，得出R01-21，R01-23，R02-23，R03-12，R03-13，R03-37，R05-23，R05-34，R05-35，R05-39，R7-28，R08-22，R08-23，R08-28，R09-11，S03，S04，S08，S10為腸球菌，與其序列同源性高達(dá)99.158%以上，R01-22，R02-22，R02-24，R03-16，R03-114，R04-31，R02-25，S06為植物乳桿菌，與其序列同源性高達(dá)98.169%以上。序列提交GenBank注冊(cè)，得到序列號(hào)R01-21(HQ603855)、R01-22(HQ603856)、R01-23(HQ603857)、R02-22(HQ603858)、R02-23(HQ603859)、R02-24(HQ603860)、R02-25(HQ603861)、R03-16(HQ603862)、R03-37(HQ603863)、R03-114(HQ603864)、R03-12(JF896447)、R03-13(JF896446)、R04-31(HQ603865)、R05-23(JF896441)、R05-34(JF896444)、R05-35(JF896434)、R05-39(JF896437)、R07-28(JF896436)、R08-22(JF896435)、R08-23(JF896440)、R08-28(JF896442)、R09-11(JF896443)、S03(JF896449)、S04(JF896438)、S06(JF896439)、S08(JF896445)、S10(JF896448)、并用MEGA4.1軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用臨近法繪制進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖1所示:

從圖1可以看出:從圖1可以看出:R02-23(HQ603859)，R01-21(HQ603855)，R09-11(JF896443)、R05-35(JF896434)，R08-23(JF896440)，R05-39(JF896437)，R05-34(JF896444)，R03-13(JF896446)，R08-22(JF896435)，R08-28(JF896442)，R03-37(HQ603863)，S03(JF896449)，S08(JF896445)，S10(JF896448)，R03-12(JF896447)，R05-23(JF896441)為Enterococcus durans的不同變異品系;R07-28(JF896436)為Enterococcus faecium的變異品系;R02-25(HQ603861)為L(zhǎng)actobacillus paracasei subsp.paracasei的變異品系;S06(JF896439)為L(zhǎng)actobacillus plantarum subsp. Argentoratensis的變異品系;R02-22(HQ603858)，R02-24(HQ603860)，R03-16(HQ603862)，R01-22(HQ603856)，R03-16(HQ603862)，R03-114(HQ603864)，R04-31(HQ603865)為L(zhǎng)actobacillus plantarum subsp.Plantarum的變異品系。

3 結(jié)論

從和田維吾爾族長(zhǎng)壽老人糞便中分離得到乳酸菌27株，通過(guò)形態(tài)學(xué)，生理生化和16S rDNA序列分析并參閱《伯杰士細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第九版)及《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》鑒定為腸球菌和植物乳桿菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和田長(zhǎng)壽老人和一般人腸道中的益生菌不僅從數(shù)量上有差異，而且種類(lèi)上也有差異，也就是說(shuō)長(zhǎng)壽老人腸道中腸球菌占優(yōu)勢(shì)，還有植物乳桿菌而一般人腸道中只能存在腸球菌。

腸道乳酸菌是腸道中占優(yōu)勢(shì)的益生菌之一，我國(guó)對(duì)部分菌種的抑菌性能進(jìn)行了研究，但對(duì)于各種益生功能的研究，技術(shù)性能和安全性能評(píng)價(jià)，將還需要大量的工作。我國(guó)對(duì)益生菌的降血脂功能和優(yōu)良菌種的選育等方面的研究還是初步階段，因此來(lái)自人體腸道的益生菌的降膽固醇研究還未見(jiàn)報(bào)道，機(jī)理研究更是空白。益生菌抑菌性能的研究在國(guó)內(nèi)相對(duì)較多，但來(lái)源于人體的優(yōu)良菌株的篩選還需要大量的工作[14-16]。

為了補(bǔ)充這些空白本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)工作中我們從已鑒定的27株乳酸菌中篩選出抑菌活性比較強(qiáng)，有降膽固醇功能，安全性高的益生菌菌株并該菌株與長(zhǎng)壽的關(guān)系進(jìn)行初步研究。長(zhǎng)壽成為全世界人們共同話題的情況下本研究的進(jìn)行從開(kāi)發(fā)新的益生菌產(chǎn)品，促進(jìn)人類(lèi)健康，延長(zhǎng)人類(lèi)歲數(shù)等方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 王斌，李秋榮，劉放南等.1株腸道高黏附性乳桿菌的分離鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008.

[2] 于景華，李里特.健康人腸道益生菌的分離，篩選，功能特性及應(yīng)用研究[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[3] 趙佳銳，楊虹.人體腸道益生菌的分離鑒定、抑菌和降脂功能研究[D].上海交通大學(xué)，2005.

[4]李云天，袁越.百歲老人現(xiàn)狀及長(zhǎng)壽經(jīng)驗(yàn)研究[J].中國(guó)長(zhǎng)壽網(wǎng).2007.

[5] 東秀珠，蔡妙英．常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]．北京:科學(xué)出版社，2001.

[6] 孫雪.雙歧桿菌的分離純化及其培養(yǎng)技術(shù)的初步研究[D].河南科技大學(xué)，2005.

①基金項(xiàng)目:新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金(XJYS0203-2009-03)和中國(guó)科學(xué)院心理研究所合作項(xiàng)目(140696)

①作者簡(jiǎn)介:麥熱姆妮薩·艾麥爾(1980年～)，女，研究生，研究方向:資源微生物。

烏斯?jié)M·依米提(1962～)、男、副教授、博士、研究方向-微生物資源開(kāi)發(fā)