不同電刺激對卒中后大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響

馬明明 王雪晶 方燕南 李 瑋 張杰文

1）河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003 2）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3）中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 廣州 510080

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，具有高發(fā)病率、高病死率及高致殘率的特點，給患者家庭及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，而缺血性卒中是腦卒中的主要類型，約占所有卒中的75%［1］。如何迅速缺血損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的功能，成為目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點問題。電針是治療腦梗死的重要方法之一，既往研究認(rèn)為電針治療促進(jìn)康復(fù)治療的機(jī)制是促使神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和遷移。但對頭皮電針刺激和肢體電針刺激的有效性，國內(nèi)外至今未見報道。

為探討肢體電針刺激和頭皮電針刺激對急性缺血性腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)功能和神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，本研究選取SD大鼠成功建立電凝法大腦中動脈閉塞模型，在術(shù)后24h開始分別用頭皮電針刺激和肢體電針刺激的方法對腦梗死后大鼠開始治療。在梗死后7d、14d、21d時以橫木行走試驗進(jìn)行神經(jīng)功能評分，同時對室管膜下區(qū)進(jìn)行BrdU的免疫組化染色。觀察不同部位電針刺激對卒中后大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響，為腦梗死的康復(fù)治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：本實驗采用的二級SD大鼠由廣東省醫(yī)用實驗動物中心和中山大學(xué)實驗動物中心提供，雄性，2～3月齡，符合國家衛(wèi)生部頒發(fā)的實驗動物清潔級標(biāo)準(zhǔn)。實驗期間所用動物飼養(yǎng)于中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)條件為清潔級，5～10只／籠，任意供水，鼠糧用飼水浸軟后喂給，飲用自來水，動物房溫度控制在20℃左右，光暗周期24 h。實驗動物用完全隨機(jī)法分組。

1.1.2 儀器和試劑：雙極眼科電凝鑷／GD350－S型電凝器由上海瀘通電子有限公司生產(chǎn)；JD－9605型電腦針灸治療儀由上海晉電成套設(shè)備有限公司生產(chǎn)；SDR－I型大鼠心率血壓計由中日友好醫(yī)院研制 ；全自動脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)均由德國Leica公司生產(chǎn)；日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡和德國產(chǎn)ZEISS Axiotron研究型顯微鏡。TTC（triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯四唑）染色試劑和Brdu抗體均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立：選用2～3月齡，體質(zhì)量80～120g雄性SD大鼠95只。85只大鼠按我們已建立的方法復(fù)制RHRSP模型。另10只大鼠作RHRSP模型假手術(shù)對照，只打開腹腔，不進(jìn)行雙側(cè)腎動脈夾閉術(shù)。腎動脈狹窄術(shù)12周內(nèi)死亡3只，剔除2只血壓低于24kPa（180mmHg）、5只有卒中癥狀和體征者，取血壓＞24kPa且無腦卒中癥狀，體質(zhì)量450～500g的RHRSP 75只，采用 Wahl等［2］的方法加以改良制作MCAO模型。

63只用于MCAO模型制作，余下的12只行假手術(shù)（相同的開顱術(shù)，但不凝閉 MCA主干）。63只鼠中成功制成MCAO模型者54只，另9只鼠因MCAOMCAO后出血多或手術(shù)顯微鏡下未明確供血是否中斷視為不成功未入組。54只MCAO鼠隨機(jī)分為梗死灶周圍電刺激組（A組）肢體電刺激組（B組）和對照組（C組）各18只，A和B組在MCAO后24h開始進(jìn)行電刺激治療，C組和假手術(shù)組（D組）不進(jìn)行治療。每組根據(jù)電刺激治療時間不同于MCAO后1d、2d（電刺激后1d）、7d、14d、21d、28d各3只取腦檢測各項指標(biāo)。1.2.2 電刺激治療方法：MCAO后24h，行電刺激治療的2組大鼠（A組、B組）用JD9605型電腦針灸治療儀（上海產(chǎn)）行電刺激，不同的刺激組選擇不同的穴位進(jìn)行干預(yù)治療。①A組選擇梗死灶周圍頭皮進(jìn)行電刺激治療，1次／d。頻率75次／min，電流1～2mA，20min／次。1d實驗組大鼠治療24 h后，于次日處死待查。1周實驗組治療6次后，于次日處死待查。2周、3周、4周實驗組大鼠6d治療1個療程，停1d進(jìn)行下個療程治療，每個療程結(jié)束后次日處死。②B組選穴為病灶對側(cè)相當(dāng)于人的“曲池”、“外關(guān)”、“太沖”及“足三里”，上述同樣強(qiáng)度和時間的電刺激干預(yù)治療。③C組大鼠和D組大鼠不進(jìn)行電刺激治療。

1.2.3 大鼠肢體功能評分：參照Feeney運(yùn)動功能評分方法［3］，各組大鼠在大腦中動脈閉塞（MCAO）術(shù)前及 MCAO后第1周、第2周、第3周、第4周進(jìn)行橫木行走試驗檢查，以判斷肢體功能恢復(fù)的程度。

1.2.4 HE染色和分子病理檢測：每組大鼠在不同的時間點上處死后，每個時間點上每組大鼠取2只立即斷頭取腦，剝離血管和硬腦膜后，觀察梗死灶外觀。置于2%TTC溶液中，37℃避光恒溫箱孵育30min，取出腦，放在－20℃冰箱10 min。待腦組織稍硬后，使用鋒利刀片，由腦的前極向后極，冠狀切片，片厚約2mm，再置于2%的TTC溶液中，37℃避光溫育30min，然后轉(zhuǎn)移至用PBS配置的4%的多聚甲醛中固定。使用Leica脫水機(jī)連續(xù)脫水17.5h，常規(guī)石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片（5μm厚），按我室常規(guī)方法，進(jìn)行HE染色。觀察缺血中心與缺血周邊區(qū)的腦缺血損傷的組織特點。同時選連續(xù)切片進(jìn)行Brdu的免疫組化染色。免疫組化染色按試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）提供的染色步驟進(jìn)行。

1.2.5 染色結(jié)果分析和統(tǒng)計學(xué)處理：采用顯微鏡下計數(shù)的方法對免疫組化的陽性進(jìn)行計數(shù)，每個時相點4只動物，以皮層、海馬DG和SVZ為觀察部位，每只動物每個部位各取切片10張，其中每相鄰兩張切片分別行Brdu和Nestin免疫組化染色，切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)（10×20）下，隨機(jī)選擇10個視野，在生物系統(tǒng)顯微鏡（日本，OLYMPUS BX51型）下，數(shù)出每個視野的陽性細(xì)胞后計算每只鼠所要分析部位的平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究所得結(jié)果以BZ_15_1694_320_1782_360表示，全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，選用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大鼠肢體功能評分 見表1。

表1 不同時期MCAO大鼠神經(jīng)功能評分比較 （BZ_15_1694_320_1782_360）

按照Feeney運(yùn)動功能評分方法。假手術(shù)組無運(yùn)動功能缺損，評分均為7分（正常）。如表1所示，電刺激刺激前A組、B組及C組3組間評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。電刺激后第1周，A組分別與B組、C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而B組與C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。電刺激治療后第2周，A組與B組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩者分別與C組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此時3組評分較刺激前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。刺激后第3～4周A組與B組評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），二者與C組（對照組）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較，刺激后第1周開始，A組、B組、C組和刺激前相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此種現(xiàn)象一直持續(xù)至第4周。

2.2 病理大體觀察與HE染色 MCAO后1d，可見大鼠額、頂、顳葉腫脹，呈蒼白色，左右大腦半球不對稱，缺血側(cè)水腫明顯；MCAO后14d時在大腦中動脈供血范圍內(nèi)（以皮層為主）出現(xiàn)肉眼可見的壞死液化灶，壞死液化區(qū)隨動物的不同而有差異。冠狀切片HE染色可見皮質(zhì)缺血區(qū)。HE染色切片上可見，缺血壞死灶并未累及側(cè)腦室和海馬，缺血區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤（包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞），組織水腫、疏松，細(xì)胞層次紊亂，缺血中心區(qū)出現(xiàn)壞死液化腔，但缺血14d后炎性改變逐漸消失。

2.3 室管膜和室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá) MCAO后1、2、7、14、21、28d所有缺血組（A組、B組、C組）與 D組比較，BrdU陽性細(xì)胞均顯著增加（P＜0.05）。A組及B組缺血后室管膜Brdu表達(dá)與C組比較在7d、14d差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），MCAO后7d二者Brdu在室管膜和室管膜下區(qū)的表達(dá)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MCAO后21dA組Brdu的表達(dá)和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但此時B組和C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在 MCAO后1 d及28d三者Brdu均有表達(dá)但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表2 4組不同時期Brdu在室管膜上皮和室管膜下區(qū)的表達(dá)情況 （）

表2 4組不同時期Brdu在室管膜上皮和室管膜下區(qū)的表達(dá)情況 （）

注：采用K－W 檢驗，與假手術(shù)相比，▼P＜0.05；與C組相比，△P＜0.05

組別 第1天 第2天 后第7天 第14天 第21天 第28天A組 13.10±1.18▼ 21.34±2.11▼ 77.42±3.64▼☆△ 46.82±5.32▼△ 28.42±4.96▼△ 18.32±3.52▼B組 13.21±1.85▼ 18.36±2.09▼ 45.24±2.65▼△ 36.21±8.43▼△ 19.15±5.39▼ 16.82±2.10▼C組 12.15±2.20▼ 14.65±1.67▼ 25.37±2.13▼ 18.44±4.45▼ 14.81±4.23▼ 14.46±3.62▼D組 7.85±1.05 7.34±1.08 6.35±1.35 6.20±2.15 7.75±1.45 8.01±1.15

3 討論

功能電刺激在1960年已開始用于功能再訓(xùn)練［2］。1990年Jenkin等［3－4］證實：反復(fù)的周圍神經(jīng)刺激可以影響腦中樞系統(tǒng)，在功能恢復(fù)訓(xùn)練中，可按需從周圍進(jìn)行不同的刺激以達(dá)到影響腦中樞的目的。隨著神經(jīng)生物學(xué)、分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，有關(guān)針刺保護(hù)缺血性腦損傷調(diào)節(jié)機(jī)制的研究取得一定進(jìn)展。神經(jīng)前體細(xì)胞是指存在神經(jīng)系統(tǒng)能夠增殖分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞。Brdu作為一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細(xì)胞增殖周期的S期可嵌入細(xì)胞核DNA中，用免疫組化方法檢測出來，因而Brdu陽性細(xì)胞可看作具有增殖活性的前體細(xì)胞。研究認(rèn)為成年哺乳動物海馬齒狀回（DG）、SVZ存在神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs），且終生具有增殖能力［5］。位于海馬顆粒下層（SGZ）的NPCs發(fā)生增殖后，新生細(xì)胞移行至顆粒層（GCL），繼續(xù)分化；起源于SVZ的神經(jīng)前體細(xì)胞，通過嘴側(cè)遷移流動到達(dá)嗅球（OB），也可進(jìn)入鄰近皮質(zhì)分化為成熟神經(jīng)元［6－7］。而缺血作為內(nèi)源性增殖的強(qiáng)烈誘導(dǎo)因素可促使NPCs增殖、移行及分化［7］。既往研究證實電刺激能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和遷移，但頭皮電針刺激和肢體電針刺激孰優(yōu)孰略，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報道。

本研究以電凝法成功制作大腦中動脈閉塞模型后觀察發(fā)現(xiàn)，MCAO后1、2、7、14、21、28d缺血各組與 D組比較，BrdU陽性細(xì)胞均有顯著增加（P＜0.05），28d時A組、B組與C組相比Brdu陽性細(xì)胞的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這說明只要在缺血因素作用下，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會發(fā)生增殖，這種增殖在缺血后24h已經(jīng)開始出現(xiàn)，從實驗數(shù)據(jù)可以看出，在缺血第7天各缺血組的干細(xì)胞增殖（Brdu表達(dá)量）較術(shù)前明顯增加，達(dá)到高峰；MCAO后14d神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)開始降低，MCAO后28d神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)和C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這是因為28d時神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了分化，分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，此時神經(jīng)干細(xì)胞的水平接近術(shù)前狀態(tài)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與既往他人研究結(jié)果一致［8－11］。

本研究Brdu免疫組化發(fā)現(xiàn)，A組、B組和C組相比，梗死灶周圍頭皮電刺激治療可促進(jìn)手MCAO后7d、14d大腦皮質(zhì)的細(xì)胞增殖（P＜0.05），手 MCAO后21d、28d梗死灶周圍頭皮電刺激治療組大腦皮質(zhì)無Brdu細(xì)胞增殖；肢體電刺激治療組大腦皮質(zhì)的Brdu陽性細(xì)胞在各個時間點與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在5個時間點上均無表達(dá)。兩個治療組對缺血7d、14d、21d后室管膜BrdU的表達(dá)與C組比較均有顯著性差異，二者相比Brdu在室管膜和室管膜下區(qū)的表達(dá)有顯著性差異；在MCAO后1d和28d三者間Brdu均有表達(dá)但無顯著性差異。以上證明MCAO大鼠有無電刺激干預(yù)治療均可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，但電刺激更易引起神經(jīng)干細(xì)胞增殖，以梗死灶周圍頭皮電刺激治療后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖明顯。電刺激對缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的影響，我們認(rèn)為主要與電刺激的以下幾個作用有關(guān)［12－16］：（1）電刺激可促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）的基因表達(dá)；（2）電刺激可增加腦缺血后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及其受體TrkA的表達(dá)；（3）電刺激可促進(jìn)腦缺血后腦內(nèi)堿性成纖維生長因子（bFGF）的表達(dá)。而這些細(xì)胞因子都已經(jīng)被證明與腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生關(guān)系密切。

綜上所述，電刺激促進(jìn)腦缺血后大鼠的肢體功能康復(fù)，神經(jīng)癥狀學(xué)評分有明顯改善，梗死灶周圍頭皮的電刺激治療較肢體電刺激治療改善程度好。電刺激促進(jìn)MCAO后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但梗死灶周圍頭皮電刺激治療較肢體電刺激治療引起的神經(jīng)干細(xì)胞增殖明顯，二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此研究可能為臨床上腦梗死患者電刺激治療的方案選擇提供一定的理論依據(jù)。

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