觀光木ISSR-PCR反應體系的建立及優化

吳雪琴，徐剛標，梁 艷，王家慶

觀光木ISSR-PCR反應體系的建立及優化

吳雪琴1，徐剛標1，梁 艷1，王家慶2

(1.中南林業科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004；2.韶關國有河口林場，廣東 韶關 512532 )

利用正交設計實驗對影響觀光木ISSR-PCR擴增的主要因素(模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+的濃度，TaqDNA聚合酶的用量以及退火溫度)進行優化， 建立觀光木ISSR-PCR反應的最佳體系。結果表明:最佳反應體系(20 μL)為:模板DNA 50 ng，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，MgCl22.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。擴增反應程序為:94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35個循環；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃ 保存。該反應體系的建立，為觀光木遺傳多樣性分析提供了客觀可靠的方法。

觀光木；正交優化； ISSR-PCR；遺傳多樣性

觀光木Tsoongiodendron odorum Chun為木蘭科觀光木屬常綠大喬木，是單種屬古老孑遺樹種，是國家二級重點保護植物[1]，對研究古代植物區系、古地理、古氣候都有重要的科學價值[2]。該種分布區很廣，湖南、江西南部、福建、廣東、廣西、云南東部、海南等地均有零星分布，其中，以南嶺山地種群數量相對較多。近年來，觀光木研究主要集中在生物學特性、育苗造林技術、生態學特性等方面[3]，僅見黃久香等[4-5]采用RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)研究觀光木遺傳多樣性報道，但種群數量少，研究結果難以代表整個物種的變異水平。

基于PCR技術的ISSR( inter simple sequence repeat)標記已成功地應用于種群遺傳結構分析，與RAPD標記相比，ISSR比RAPD重復性好[6]。為了建立觀光木ISSR-PCR反應的最佳體系，本研究利用正交設計實驗對影響觀光木ISSR-PCR擴增的重要因素進行優化，旨在為采用ISSR標記研究觀光木種群遺傳多樣性奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料于2011年4月底采集于貴州省黎平縣。采回的觀光木新鮮葉片置于-70 ℃冰箱中保存。參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）2006年公布的ISSR引物序列，由上海英俊生物技術有限公司合成。經初步篩選出的854號引物，即(TC)8RG作為此次反應體系優化實驗的固定引物。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

觀光木葉片基因組DNA提取，采用改良的CTAB法及參考文獻[4-8]并略作改動。用Eppendorf公司的Biophotometer核酸蛋白分析儀檢測DNA含量和純度，用0.8﹪瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總DNA質量，用G-BOX紫外凝膠成像系統觀察DNA是否污染并拍照記錄。

1.2.2 ISSR-PCR擴增

以提取的觀光木 DNA樣品為模板，進行ISSR-PCR擴增。擴增程序參考相關文獻[7]:94 ℃預變性 5 min，接著進行 35個循環:94 ℃變性 1 min，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s；循環結束后，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。

反應體系總體積為20 μL，其中包括1×PCR Buffer，其它成分(模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶)按照試驗設計所分析的濃度加入，不足20 μL用超純水補足。

1.2.3 ISSR-PCR擴增體系的單因素試驗設計

為保證試驗的準確性、可重復性和ISSR-PCR擴增效果，本實驗對模板DNA，Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物等 5個主要影響因子進行優化篩選，通過單因素實驗設計(模板DNA10～60 ng、Taq DNA聚合酶0.5～1.75 U、Mg2+1.0～3.5 mmol/L、dNTPs 0.1～0.35 mmol/L、引物0.1～0.6 μmol/L)，分別設置6個梯度，以基本擴增體系為基礎，每次改變一個因素，以確定該因素對ISSR結果的影響。

1.2.4 ISSR-PCR擴增體系的正交試驗設計

根據單因素實驗的結果，設計正交試驗方案，最終確定ISSR-PCR擴增的最佳反應體系。

1.2.5 ISSR-PCR擴增產物的檢測

擴增產物采用1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液1×TAE，電壓5 V/cm。當溴酚藍指示劑距離前沿約2～3 cm時停止電泳，用G-BOX紫外凝膠成像系統觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 DNA純度與濃度

將提取的基因組 DNA稀釋 100倍，在UnicoTM UV-2102PC型紫外分光光度計上檢測260 nm和 280 nm的吸光值，計算所提取 DNA的純度和濃度。結果如表1所示，所提取的DNA的OD260nm/OD280nm值在1.6和2.0之間，濃度和純度都符合ISSR標記技術對DNA質量的要求[8]。

表1 DNA的紫外檢測結果Table 1 The ultraviolet absorption test of DNA

2.2 模板DNA用量對ISSR- PCR擴增結果的影響

20 μL PCR反應體系，設定6個模板DNA濃度 (ng/20 μL)梯度 (10、20、30、40、50、60)，擴增檢測結果(如圖1)表明:在其它條件一致的情況下，DNA模板量對PCR擴增的影響較小，模板DNA在10～60 ng內均能擴增出條帶。在濃度低于和等于40 ng時，擴增的條帶亮度相對較低，清晰度不高且條帶較少。模板濃度50 ng與60 ng相比，50 ng/20 μL擴增出的條帶清晰明亮，多態性最高。因此適宜的模板DNA濃度為 50 ng/20 μL。

圖1 不同模板 DNA濃度對ISSR-PCR的影響Fig 1 Effects of different template concentrations on ISSR-PCR

2.3 Taq DNA聚合酶濃度對ISSR-PCR擴增結果的影響

Taq DNA聚合酶的用量對擴增反應起著決定性的影響作用。本實驗設置了 6個Taq DNA聚合酶濃度(U)梯度 (0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75)，結果(見圖2)表明：在 20 μL反應體系中，Taq DNA聚合酶在6個遞度范圍內均得到清晰的擴增條帶，酶濃度在 1.25U時擴增得到的條帶最多，因此適宜的 Taq DNA聚合酶濃度為 1.25 U/20 μL。

圖2 不同 Taq DNA聚合酶濃度對 ISSR-PCR的影響Fig.2 Effects of different Taq DNA polymerase concentrations on ISSR-PCR

2.4 Mg2+濃度對ISSR-PCR擴增結果的影響

Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活劑，酶對 Mg2+的濃度非常敏感，其濃度將直接影響Taq酶的活性，本實驗設置了6個Mg2+濃度(mmol/L)梯度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)，由擴增結果(如圖 3)可知：在不同濃度下擴增出多態性條帶有明顯差異，濃度在2.0 mmol/L時，擴增的條帶最多且清晰明亮；濃度大于2.0 mmol/L或小于2.0 mmol/L時，均有部分條帶缺失，因此選擇適宜的Mg2+濃度為 2.0 mmol/L。

圖3 不同 Mg2+濃度對 ISSR-PCR的影響Fig.3 Effects of different Mg2+ concentrations on ISSR-PCR

2.5 dNTPs濃度對ISSR-PCR擴增結果的影響

dNTPs是PCR反應的原料，其濃度取決于擴增片段的長度。本實驗設計了6個濃度(mmol/L)梯度 (0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35)，擴增結果(如圖4 )表明:在不同濃度下，擴增的結果有較大差異。濃度越高的擴增出的條帶越不清晰，濃度過低的擴增的條帶也不理想，濃度為0.20 mmol/L時，擴增的條帶相對較多且清晰。因此選擇適宜的dNTPs反應濃度為0.20 mmol/L。

圖4 不同 dNTPs濃度對 ISSR-PCR的影響Fig.4 Effects of different dNTPs’s concentrations on ISSR-PCR

2.6 引物濃度對 ISSR-PCR擴增結果的影響

引物用量對擴增產物的質量有著至關重要的影響。本實驗設計了6個引物濃度(μmol/L)梯度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6)， 擴 增 結 果 (見圖5)表明:不同的引物濃度對擴增結果有較大的影響，濃度越低擴增條帶越不清晰，且有部分條帶缺失，濃度在0.4～0.6 μmol/L時，擴增效率逐漸增高，條帶較清晰，引物濃度為0.6 μmol/L時，條帶相對最多最清晰，因此適宜的引物濃度為 0.6 μmol/L。

圖5 不同Primer濃度對 ISSR-PCR的影響Fig.5 Effects of different primer concentrations on ISSR-PCR

2.7 ISSR-PCR正交實驗結果

由單因素實驗結果，按照正交試驗表L18(35)設計5因素3水平實驗進一步優化反應體系，結果如圖6所示。在單因素優化的基礎上，進行正交設計實驗能夠擴增出較清晰的條帶。在18個處理組中，第8組設計的實驗數據擴增的效果最好，譜帶最多而且清晰明亮，多態性高。

圖6 ISSR-PCR正交設計電泳圖譜Fig.6 Band patterns of orthogonal design of optimal ISSRPCR system

2.8 退火溫度對ISSR-PCR的影響

不同的引物有不同的退火溫度，引物UBC854以其Tm(Tm:56)值為中心，設置6個退火溫度梯度(53、54、55、56、57、58 ℃)進行PCR擴增，由結果(如圖 8)得出，引物UBC854在55 ℃時，擴增出的條帶多而亮，而低于或者高于 55 ℃，擴增的條帶相對較少且亮度淺。因此，退火溫度的高低也直接影響著擴增反應的結果，觀光木ISSR反應體系中引物UBC854最適宜的退火溫度為 55 ℃。

圖7 不同退火溫度對 ISSR-PCR的影響Fig.7 Effects of different annealing temperatures on ISSR-PCR

2.9 最優體系的驗證

為了驗證優化后的體系，選取觀光木的另外13個樣品所提取的DNA采用L18(35)中第8組設計的數據進行PCR擴增，擴增結果如圖8所示。從圖8可知:條帶的多態性與清晰度好，說明該體系能很好地滿足觀光木的ISSR遺傳多樣性研究。

圖8 其他13個樣品擴增結果Fig.8 Electrophoresis of PCR products of all 13 plant materials

3 結 論

ISSR擴增受模板、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物等因素影響，退火溫度的高低也直接影響著擴增反應的結果，不同引物的最適退火溫度不同。本研究通過正交試驗設計對影響觀光木ISSR-PCR擴增的重要因素進行優化，建立了觀光木ISSR-PCR反應的最佳體系(20 μL):模板DNA 50 ng、 TaqDNA聚合酶1.25 U、MgCl22.5 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.4 μmol/L。擴增反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35個循環；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃ 保存。該反應體系的建立為觀光木種質資源分類、遺傳多樣性分析以及分子譜系地理學研究提供了更客觀可靠的方法。

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[3] 黃松殿，覃 靜，秦武明，等.珍稀樹種觀光木生物學特性及綜合利用研究進展[J].南方農業學報,2011,42(10):1251-1254.

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Establishment and optimization of Tsoongiodendron odorum ISSR-PCR reaction system

WU Xue-qin1，XU Gang-biao1，LIANG Yan1, WANG Jia-qing2
(1.School of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China;2. State-owned Hekou Forest Farm, Shaoguang 512532, Guangdong, China)

Through the orthogonal design experiments, the important factors of the inter-simple sequence repeat PCR (ISSR-PCR)amplification system, such as DNA template，primers，dNTPs，Mg2+concentration，dose of TaqDNA polymerase and annealing temperature fit for Tsoongiodendron odorum were optimized. The results show that the optimal reaction system by the volume of 20 μL was established as follows: 50 ng DNA template，0.4 μmol/L primers，0.25 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/LMgCl2，1.25 U Taq DNA polymerase. The PCR procedure was: pre-denaturing at 94 ℃ for 5 minutes，35 cycles of denaturation at 94 ℃ for 1 minute，annealing at 55 ℃ for 30 seconds and extension at 72 ℃ for 90 seconds，with 7 minutes final extension at 72 ℃ and then stored at 4 ℃ .The orthogonal-based ISSR-PCR reaction system provided a reliable method for genetic diversity analysis in Tsoongiodendron odorum.

Tsoongiodendron odorum；orthogonal design；ISSR-PCR; genetic diversity

S718.46

A

1673-923X (2012)07-0076-04

2012-03-14

國家林業公益性行業科研專項(201104033)

吳雪琴(1987—)，女，四川樂山人，碩士研究生；主要從事分子種群遺傳學研究

徐剛標(1965—)，男，安徽樅陽人，教授，博士；主要從事森林遺傳學及林業生物技術研究

[本文編校：吳 毅 ]