橡實淀粉發酵生產酒精專用酵母菌株的篩選

李安平，謝碧霞，沈 偉，蔣雅茜

橡實淀粉發酵生產酒精專用酵母菌株的篩選

李安平1,2，謝碧霞1，沈 偉1，蔣雅茜1

（1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

從栓皮櫟自然發酵基質中分離得到的36株酵母菌，經TTC 平板顯色圖變化挑選出5株菌株，分別測試比較其發酵性能。結果表明：篩選的5株酵母菌菌落形態基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）的死亡率；在酒精濃度低于6%時，酵母菌XS03和XS04比酵母菌XS01、XS02和XS05等具有更高的耐酒精能力和耐高塘能力；發酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種菌種（P＜0.05）。

橡實淀粉；發酵；酵母菌株；篩選

能源是國家重要的戰略性資源，但化石能源存在一定的污染性和有限性，因此，人們逐漸將注意力轉移到可再生和低污染的燃料酒精能源方面[1]。但以糧食為原料的高生產成本又阻礙了燃料酒精的發展[2]。燃料酒精主要采用發酵法生產，而酵母菌株是影響發酵法中淀粉出酒率和酒精發酵質量的關鍵因素之一[3]。不同的發酵原料需要不同酒精耐受性的高產酵母菌株。篩選性能優異的酵母，不僅可以提高酒精發酵質量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生產成本[4]。

橡實 acorn，又稱為橡子，是殼斗科Fagaceae植物果實的通稱，分布區域極廣[5]。我國約有橡實300余種，估計橡實年產量有60～70億kg，然而大部分橡實并沒有得到利用[6]。橡實種仁中淀粉含量約為50%～70%，是良好的淀粉質原料[7]，因此，以橡實為原料發酵生產燃料酒精是較好的利用途徑。在眾多橡實品種中，栓皮櫟產量較高，且具有典型橡實品種特征，因此選擇以栓皮櫟為例進行研究。本研究從栓皮櫟自然發酵基質中分離出一些具有較高酒精耐受性能的酵母菌,并對該菌株的發酵性能進行初步研究，期望能為燃料酒精的工業化生產提供幫助。

1 材料與方法

1.1 原材料

栓皮櫟Quercus variabilis Blume，采自湖南南岳衡山。

1.2 設備與儀器

SHP-150型生化培養箱、DL-6M/DL-6MI大容量冷凍離心機、島津UV1700 分光光度計。

1.2.1 培養基[8]

富集培養基：葡萄糖5.0 g，酵母膏0.05 g，KH2PO40.25 g，尿素 0.1 g，，MgSO4·7H2O 0.1 g，Fe2(SO4)30.01 g，孟加拉紅（1%的水溶液），加蒸餾水至100 mL，用H2SO4調節pH至4.5，115℃溫度下高壓滅菌15 min。

分離純化培養基：葡萄糖5.0 g，酵母浸膏0.8 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂1.5 g，用蒸餾水定容至100 mL，培養基pH值用H2SO4調節至4.5，115 ℃溫度下滅菌15 min，冷卻后倒平板備用。

發酵培養基:葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.1 g, 用蒸餾水定容至100 mL，培養基pH值用H2SO4調節至4.5，115 ℃溫度下滅菌15 min。

1.2.2 菌種的培養分離[9]

將新鮮栓皮櫟樣品粉碎后置于發酵瓶中讓其自然發酵。待栓皮櫟發酵基質在發酵瓶中有大量氣泡產生時，取發酵醪液10 mL置于100 mL 酵母富集培養基中，28 ℃培養約20～24 h，然后取發酵液梯度稀釋，平板涂布，每一梯度做3個平行，28 ℃培養箱中培養48 h。將具有典型酵母菌落形態的菌落用竹簽在麥芽汁培養基平板上劃線分離，直至單菌落出現，然后鏡檢，挑選純單菌落，接種于麥芽汁試管斜面上，28 ℃培養12 h后，于4℃冰箱中冷藏備用。

1.3 酵母菌種的篩選[10]

初篩選：由菌落的顏色可初步判定酵母產酒精的能力，因此挑選具有紅色特征的菌落作為初篩選的標準。

復篩選：將初篩選出的菌株經活化后接入酒精濃度分別為0%、3%、6%、9%(V/V)的富集培養基中，于溫度為28 ℃的搖床上培養，每間隔2 h測定1次培養基的吸光度OD560，然后繪制酵母的生長曲線。通過比較酵母菌在不同酒精濃度下的生長情況篩選具有較好酒精耐受性的菌株。

1.4 酵母發酵性能測試[11]

將篩選酵母置于發酵培養基中進行常規發酵性能測試。在酵母的發酵周期內定時取樣測定發酵醪液中的pH 值、糖度、吸光度OD560和酒精度。初始酒精濃度用無水乙醇調節，初始糖度用固體葡萄糖調節。

1.5 酒精濃度的測定[12]

取100 mL發酵醪液置于500 mL的蒸餾瓶內，加蒸餾水100 mL，然后加熱蒸餾，直至餾出100 mL溶液，用酒精比重計測定其酒精度，同時測定此時的溫度，將測得的酒精度換算為20 ℃時的酒精濃度。

1.6 各酵母菌株的橡實淀粉出酒率比較實驗[13-15]

用帶發酵栓的500 mL磨口三角瓶裝入溶解了60 g栓皮櫟淀粉的300 mL發酵溶液，然后在溫度28 ℃、起始pH為4.5的條件下接入不同酵母菌株發酵。觀察5株酵母菌株在帶發酵栓的磨口三角瓶中發酵情況，分別測定12 h、24 h、36 h、48 h和60 h 的CO2失重率（失重率=某時刻CO2失重量/溶液總重量），并測定成熟發酵醪的淀粉出酒率[原料出酒率（%）=酒精產量（mL）×95%/原料耗用量（g）]。

2 結果與討論

2.1 分離和純化所得酵母菌的形態特征比較

通過富集培養、分離、鑒定和純化等的比較篩選，從橡實發酵基質中分離得到36株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，結合0.1%的TTC 平板顯色圖變化挑選出5株菌株，分別編號為XS1-5。經2～3次活化，接種于橡實淀粉基質中培養24 h，觀測菌落形態、大小、出芽率和死亡率。結果見表1。

表1 酵母菌的形態特征比較Table 1 Comparison of morphological characteristics of yeasts

從培養狀況的觀測表明，篩選的5株酵母菌菌落形態基本一致，為圓形，低凸起，邊緣整齊，不透明，表面光滑，閃光，乳白色，蠟狀。酵母菌個體普遍較大且均勻，基本尺寸在5.0～8.2×5.0～10.0 μm之間，其死亡率較低，出芽率較高。5株酵母菌相比較，XS03、XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3菌株（P＜0.05）。

2.2 各酵母菌株耐酒精能力比較

將經初篩選獲得的5株長勢較好的酵母菌接入發酵培養基中發酵，比較它們在酒精濃度(V/V)分別為0%、3%、6%、9%條件下的生長情況。結果見圖1～圖4。

圖1 0%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of yeasts with 0% alcohol concentration

圖2 3%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of yeasts with 3% alcohol concentration

圖3 6%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of yeasts with 6% alcohol concentration

圖4 9%酒精濃度下酵母菌的生長曲線Fig.4 Growth curves of yeasts with 9% alcohol concentration

從圖中可以看出，在初始發酵液中酒精濃度(V/V)為0的情況下，發酵時間不超過72 h時，5種發酵酵母的生長情況基本一致；當超過72 h時，酵母XS03和XS04的生長明顯快于其它3種酵母，此時酵母XS01、XS02和XS05的生長幾乎完全停滯。當初始發酵液酒精濃度為3%和6%時，發酵時間不超過48 h，5株菌株的生長基本一致，但超過48 h后，XS3和XS4有著較強的酒精耐受性，其生長顯著快于其它3種菌株。當初始發酵液酒精濃度為9%，5種菌株從發酵開始即受到了抑制，生長均非常緩慢。5種酵母菌株的酒精耐受能力比較表明，XS3和XS4比其它3種菌株具有更強的耐受酒精能力。

2.3 各酵母菌株耐高糖能力比較

將5種篩選的酵母菌接入初始糖度分別為5 Brix、10 Brix、20 Brix、30 Brix、40 Brix、50 Brix、60 Brix的培養基中發酵培養。在溫度為28 ℃、起始pH為4.5的條件下發酵24 h后，分別測定各菌種發酵醪液在560 nm時的吸光度值。結果見圖5。

圖5 初始糖濃度對酵母菌生長的影響Fig.5 Yeasts’ tolerance to different sugar concentrations

從圖5 可以看出，當初始糖度為20 Brix時，經過一段時間的發酵培養，5種酵母菌株發酵液的吸光度均達到最大值。隨著糖度的增大和減小，各菌株的吸光度均減小。說明以橡實為淀粉質發酵，初始糖度濃度在20 Brix左右較適合這5種酵母菌株的生長。當糖度升高到60 Brix 時，酵母生長趨于停頓。5種酵母菌株發酵比較表明，XS03和XS04發酵速度明顯快于XS01、XS02和XS05等3種菌株。XS03和XS04的生長曲線一直位于其它3種菌株生長曲線的上方，說明該菌株對高糖的耐受能力更強。

初始發酵糖濃度對酵母菌生長存在一定的影響，如果糖濃度過低會使酵母菌因營養不足而導致生長緩慢；如果糖濃度過高又會因滲透壓增大而抑制酵母菌的生長繁殖。因此，選擇20 Brix左右的糖度對以橡實為原料的酵母菌是較合適的。

2.4 各酵母菌株的淀粉出酒率比較

酵母菌株在發酵過程中，利用淀粉質原料不斷產生酒精，釋放出CO2，其重量隨之減少。不同酵母菌株的代謝能力有差異，對淀粉質原料的利用程度不同，導致最終淀粉的出酒率也存在差別。各酵母菌株的各時段的CO2失重率及出酒率見表2。

表2 發酵醪液的CO2失重率及出酒率比較Table 2 Comparison of weight loss rate of CO2 and conversion rate of alcohol among fermented mashes

由表2可知，發酵24 h后各菌株間的失重率沒有顯著性差異（P＞0.05），但發酵36 h后各種酵母繼續產生CO2，重量不斷減輕，各酵母間的失重率存在顯著性差異（P＜0.05），XS03和XS04的失重率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種菌種。此后各菌株仍在不斷發酵產生CO2，在48 h和60 h時測定的各菌株間發酵狀況和36 h的發酵狀況是一樣的，但48 h和60 h間的失重率變化較少，說明發酵到48 h時基本結束。對以栓皮櫟淀粉為原料的生產燃料酒精，5種菌株在淀粉出酒率方面有顯著性差異，XS03和XS04兩菌株的出酒率比XS01、XS02和XS05等3菌株要高。

3 小 結

橡實是一種資源豐富，淀粉含量高，但尚未得到有效開發利用的資源，以橡實淀粉為原料開發燃料酒精具有現實可行性。研究表明，從栓皮櫟自然發酵基質中分離得到的5株優良酵母菌性能測試顯示，篩選的5株酵母菌菌落形態基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率顯著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）。在酒精濃度低于6%時發酵，XS03和XS04比XS01、XS02和XS05等具有更強的生命活力和耐高塘能力，發酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率顯著高于XS01、XS02和XS05等3種酵母菌（P＜0.05）。因此，酵母XS03和XS04是較適合栓皮櫟淀粉發酵生產燃料酒精的菌株。

[1] Renyong Zhao, Scott Bean, Xiaorong Wu, et al. Assessing Fermentation Quality of Grain Sorghum for Fuel Ethanol Production Using Rapid Visco-Analyzer[J]. Cereal Chemistry,2008, 85(6): 830-836.

[2] 李安平,謝碧霞,田玉峰,等.橡實淀粉生料發酵生產燃料酒精工藝研究[J].中國糧油學報,2011,26(3):91-94.

[3] 趙祥杰,楊榮玲,肖更生,等.桑椹果酒專用酵母的篩選及鑒定[J].中國食品學報,2008,8(1):60-66.

[4] 雙 寶,李 明,李 慧,等.一株酒精酵母的分離及其發酵性能分析[J].東北農業大學學報,2011,42(6):130-134.

[5] 謝碧霞,謝 濤.我國橡實資源的開發利用[J].中南林學院學報,2002,22(3):37-41.

[6] 胡芳名,李建安.湖南省主要橡子資源綜合開發利用的研究[J].中南林學院學報,2000,20(4):41-45.

[7] 謝碧霞,陳 訓.中國木本淀粉植物[M].北京:科學出版社,2008,5.

[8] 趙祥杰,肖更生,楊榮玲,等. 桑椹果酒酵母篩選及發酵性能[J].食品與生物技術學報,2007,26(1):95-99.

[9] 張慧敏,姚善涇,彭立鳳,等.在不同碳源培養條件下釀酒酵母的蛋白質組解析[J].生物工程學報,2004,20(3):398-402.

[10] Bai F W, Anderson W A, Moo-Young M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks[J]. Biotechnology Advances, 2008, (26): 89-105.

[11] Atsushi KOTAKA, Hiroshi SAHARA, Yoji HATA, et al.Efficient and Direct Fermentation of Starch to Ethanol by Sake Yeast Strains Displaying Fungal Glucoamylases[J]. Biosci.Biotechnol. Biochem., 2008, 72 (5): 1376-1379.

[12] 田玉峰,李安平,謝碧霞,等.橡實淀粉生物乙醇化橡實品種和菌種的篩選[J].食品科學,2011,32(7):207-210.

[13] Lee Hyang Aeea, Kim Nam Hiea, Katsuyoshi Nishinarib,et al. DSC and rheological studies of the effects of sucrose on the gelatinization and retrogradation of acorn starch[J].Thermochimica Acta, 1998, (322): 39-46.

[14] 聶世現,王 鈺,黃文靜,等. 高產酒精酵母菌株及甘薯品種篩選[J].食品工業科技,2011,32(2):159-162.

[15] 田玉峰, 李安平, 謝碧霞,等.橡實淀粉可食用性技術的研究[J].中南林業科技大學學報,2010,30(7):94-99.

Screening of special yeast for ethanol production by acorn starch fermentation

LI An-ping1,2, XIE Bi-xia1, SHEN Wei1, JIANG Ya-qian1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.National Engineering Lab. for Rice and Byproducts Processing, Changsha 410004, Hunan, China)

36 yeast strains has been isolated from cork oak natural fermentation matrix, of them, five strains were selected by using the TTC plate change color chart, their’s fermentation performance were tested and compared each other. The results show that the colony morphology of the five yeast colonies were basically identical, but the yeast XS03 and XS04 mortality rate were significantly lower than the XS01, XS02 and XS05 other three yeast strains (P ＜0.05) mortality; under the condition of alcohol concentrations less than 6%, yeast XS03 and XS04 had higher alcohol tolerance and higher Gaotang resistance capacity than XS01, XS02 and XS05, etc. the weight loss rate and the yield of liquor of yeast XS03 and XS04 after being fermenting 36 hours, were significantly higher than that of XS01, XS02 and XS05 (P ＜0.05).

acorn starch; fermentation; yeast strain; screening

S789

A

1673-923X(2012)08-0098-05

2011-11-07

林業公益性行業科研專項“野生木本淀粉種質資源評價與精加工技術研究”（200804033）；湖南省科技計劃項目“橡實淀粉生物乙醇關鍵技術研究”（2010NK3040）

李安平（1967—），男，湖南永州人，教授，博士，主要從事林副產品深加工研究；E-mail：lianpinglianping@yahoo.com.cn

[本文編校：文鳳鳴]