米良一號獼猴桃遺傳轉化體系的建立

田宏現 ，苑 平 ，王曼玲 ，劉 藝 ，李 菁 ，夏新界 ，譚曉風

米良一號獼猴桃遺傳轉化體系的建立

田宏現1，2，苑 平2，王曼玲3，劉 藝2，李 菁2，夏新界3，譚曉風1

（1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.吉首大學，湖南 吉首 416000；3.中國科學院 亞熱帶農業生態研究所，湖南 長沙 410125）

為建立獼猴桃基因功能研究技術平臺并通過生物技術改良獼猴桃, 選用米良一號葉片和莖為外植體,通過優化培養基, 建立了適合轉化的高效再生系統,通過農桿菌介導將ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）氧化酶基因成功轉化米良一號,構建了根癌農桿菌介導米良一號遺傳轉化體系。結果表明，TD培養基為合適的愈傷誘導培養基,誘導率達100%,愈傷經3次繼代培養轉入分化培養基,分化率為90%。共獲得29株潮霉素抗性植株,隨機挑選 14株經PCR檢測,其中10株檢測到ACC氧化酶基因目的條帶,陽性植株占71.4%。

獼猴桃；根癌農桿菌；轉化體系；組織培養

獼猴桃原產中國，是一種營養價值極高的水果，素有“果中之王”的美譽。它含有多種氨基酸，以及豐富的礦物質、胡蘿卜素和多種維生素，對保持人體健康具有重要的作用。維生素C含量比柑桔高5至10倍，是各種水果中營養成份最豐富、最全面的水果。也對多種疾病有著很好的預防和治療的作用。

米良一號獼猴桃是吉首大學石澤亮教授于20世紀80年代選育出來的美味獼猴桃優良品種，它具有適應性強、果大、結果早、產量高、含糖量高、含維生素C高、較耐貯等優點。目前已推廣至15個省市，全國種植面積1.3萬hm2。其中湘西自治州約0.5萬hm2。獼猴桃生產已成了我國山區廣大農民脫貧致富的重要途徑[1]。

ACC氧化酶是乙烯生物合成途徑的關鍵酶，它直接催化ACC(1-氨基環丙烷-1-羧酸)轉變為乙烯，通過調節它的表達能有效地調節乙烯的合成量，從而達到控制果實成熟時間的目的。

目前國內外對獼猴桃各個品種組織培養的研究已經很充分，但分子方面的研究還不是很多，目前未見關于米良一號根癌農桿菌介導轉化的報道[2-3]。以米良一號獼猴桃葉片和莖為外植體，誘導出愈傷。本文通過對誘導、繼代、分化、生根培養基的研究建立了米良一號高效再生系統，并從共培養、篩選培養、預分化等步驟建立米良一號根癌農桿菌介導轉化體系，為開展米良一號基因組學研究和獲得耐貯、高抗性品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

受體植物材料：選取米良一號優良單株上無病蟲害的1年生硬枝和當年生嫩枝及葉片為材料。

菌種和質粒：根癌農桿菌菌株為EHA105，質粒為pCAMBIA1300-163，為中科院亞熱帶農業生態研究所提供。該質粒T-DNA區結構如圖1，其中含有潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)。

圖1 植物表達載體pCAMBIA1300-163的T-DNA區Fig.1 Schematic representation of the T-DNA region of plasmid pCAMBIA1300-163

培養基：

誘導培養基TD：MS + 10 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1NAA + 0.2 mg·L-1TDZ + 30 g·L-1蔗糖 +7.5 g·L-1瓊脂；

繼代培養基Y1:MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂；

共培養基YA：MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 0.1 mmol乙酰丁香酮+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 5.6；

篩選培養基YS:MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA+500 mg·L-1頭胞霉素+400 mg·L-1羧芐青霉素+ 20 mg·L-1潮霉素+ 30 g·L-1蔗糖+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

預分化培養基ZD3:MS+3.0 mg·L-1ZT+0.5 mg·L-16-BA + 0.05 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+ 400 mg·L-1羧芐青霉素+7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

分化培養基ZD：MS+1.0 mg·L-1ZT+30 g·L-1蔗糖+ 400 mg·L-1羧芐青霉素+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

生根培養基YR:1/2MS + 0.7 mg·L-1IBA +0.15 mg·L-16-BA + 15 g·L-1蔗糖+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0。

1.2 組織培養

1.2.1 獼猴桃愈傷組織的誘導

挑選供試材料有芽莖段先用洗衣粉洗滌，隨后盛于塑料桶中用自來水流水沖洗48 h。接種時先用75%的乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞溶液消毒8～10 min，無菌水沖洗5～6次。將滅菌枝條切成0.6～0.8 cm長的莖段外植體，于滅菌濾紙上晾干，然后接種到誘導培養基上，每瓶2節外植體，25 ℃～26 ℃，14 h光照培養，光強1000～1500 lx[1]。

取獼猴桃無菌苗葉片，切成0.5 cm × 0.5 cm大小的葉盤，葉片正面向上于誘導培養基上避光培養，7 d左右可以看到葉脈及葉片邊緣處開始膨大，愈傷開始生長。

1.2.2 愈傷組織繼代

接種外植體30 d后轉入繼代培養基繼代，每20 d繼代1次，連續繼代3次，觀察愈傷狀態。

1.2.3 愈傷組織分化

挑選繼代3次的愈傷轉入分化培養基，20 d后統計分化率(分化率=能分化出植株的愈傷數/接入愈傷總數×100%)。

1.3 反義表達載體的構建

從獼猴桃中克隆得到ACC氧化酶基因的cDNA片段，測序確定為所需片段后將其反向連入表達載體pCAMBIA1300 + 163當中，得到獼猴桃ACC氧化酶基因的反義表達載體。

1.4 遺傳轉化

1.4.1 農桿菌與愈傷組織的共培養

EHA105(含pCOsAc1300 + 163質粒)劃LB板(加 Kan 50 mg·L-1和 CHL 34 mg·L-1)，28 ℃培養2 d后挑單菌落，在LB板(加Kan 50 mg·L-1和CHL 34 mg·L-1)劃線至全培養皿，28 ℃過夜培養，用液體共培養基將菌洗下，調OD600=0.6挑選表面干爽結構致密的愈傷組織浸入上述準備好的菌液中，浸泡30 min，每隔5 min搖一次。用滅菌濾紙吸干表面多余菌液。將愈傷轉移到固體共培養基，在培養基表面鋪一層用液體共培養基浸濕的滅菌濾紙，25 ℃～26 ℃下暗培養3～4 d[4]。

1.4.2 抗性愈傷組織的篩選

3 d后，將共培養的愈傷組織轉入滅菌三角瓶，滅菌水沖洗5～6次至液體不渾濁，再用加有500 mg·L-1頭胞霉素和400 mg·L-1羧變青霉素的滅菌水浸泡30 min，每隔5 min搖一次。用滅菌濾紙吸干水分，轉移到篩選培養基YS中，25 ℃～26 ℃暗培養，20 d后將抗性愈傷轉入新的篩選培養基。

1.4.3 抗性愈傷組織的分化

兩次篩選后，將抗性愈傷轉移至預分化培養基ZD3，置于25 ℃～26 ℃，每天14 h光照培養，光強1000～1500 lx，每20 d更換一次新培養基。當愈傷開始變成紅褐色并開始分化出芽時將愈傷轉移至分化培養基ZD上。

1.4.4 抗性植株的生根

綠苗長至約3～5 cm，轉移到生根培養基YR，置光照培養箱中，條件同預分化。

1.4.5 抗性植株的練苗

挑根多而粗壯的抗性植株，擰松瓶蓋于室內煉苗3d后用自來水將幼苗上的培養基沖洗干凈，移栽到裝有泥土（基質土∶珍珠巖=3∶1）的盆子，置于置物箱中室內練苗2周后打開置物箱室內練苗3 d，移至室外1周左右即可移入實驗田中。

1.5 抗性植株的PCR檢測

DNA提取：取抗性獼猴桃植株幼嫩葉片0.2～1.0 g，采用CTAB區室法提取基因組DNA。

PCR擴增:擴增產物為575 bp的基因片段。

上 游 引 物 為 Term F：5′ -GGT，GCT，TTC，CCA，GTC，CAA，ATC，GTT-3′。

下 游 引 物 為 Term R：5′ -CCA，GGT，TTA，GTC，GTC，TCG，TGT，CTG，GT-3′。

PCR擴增體系(20 μL)：Takara公司TaqDNA聚 合 酶 (5 mmol·μL-1)0.2 μL，10×Buffer (KCl)緩 沖 液 2.0 μL，MgCl21.6 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，Term F(20 mmol·μL-1)0.4 μL，Term R(20 mmol·μL-1)0.4 μL，模板 1 μL，ddH2O 12.4 μL。

PCR反應程序為：95 ℃變性5 min后運行下循環，94 ℃ 35 s，59 ℃ 35 s，72 ℃ 45s，共 35 個循環，最后72 ℃ 10 min。取PCR產物10 μL進行常規瓊脂糖(1.0%)凝膠電泳分離并照相保存。

2 結果與分析

2.1 誘導培養基對獼猴桃愈傷誘導率的影響

莖段愈傷的誘導可選用Y1或者ZD為誘導培養基，愈傷誘導所需時間比葉片要長，主要是沿切口處開始生長。莖段愈傷結構致密，顏色較深，分化出芽的效率相對較低，而且米良一號內生菌比較多，用莖段誘導愈傷染菌率較高。

葉片誘導培養基選用TD，葉片接到培養基后，7天左右可以看到葉脈及葉片邊緣處開始膨大，愈傷開始生長，除去壞死的葉片，獼猴桃葉片愈傷誘導率為100%（圖2-A），且在TDZ的培養基上即可直接分化出芽。

圖2 米良一號農桿菌介導的遺傳轉化體系Fig.2 Genetic transformation of Miliang-1 by Agrobacterium-mediated method

2.2 繼代培養基對獼猴桃愈傷組織的影響

繼代培養基選用Y1，愈傷組織在此培養基都能很好的生長，20 d左右繼代一次。愈傷組織在此培養基上繼代后，結構致密，顏色翠綠，基本上不會出現褐化，但當繼代時間超過30 d時，愈傷結構開始變的疏松，顏色變白，后期分化效率變低。可能是培養基中營養物質基本上消耗完畢而有害物質積累過多造成的，所以20 d左右必須繼代一次，繼代次數超過3次后，愈傷狀態仍然保持很好的活力，基本上沒有出現愈傷褐化的現象（圖2-B）。

2.3 篩選時潮霉素濃度對米良一號愈傷生長的影響

以Y1為培養基，在其中添加潮霉素用于篩選抗性愈傷，添加頭孢霉素和羧變霉素用于抑制農桿菌的生長，將潮霉素濃度設為5個梯度，每個梯度10個皿，每個皿9個愈傷，即每個梯度90個愈傷，19 d后統計結果如表1所示。當潮霉素濃度達到40 mg·L-1時愈傷的存活率只有10%，當濃度為50 mg·L-1時愈傷全部死亡，而將潮霉素濃度降低到20 mg·L-1時愈傷的存活率為43.3%，最終在繼代培養基中添加20 mg·L-1的潮霉素用于抗性愈傷的篩選（圖2-C）。

表1 潮霉素對愈傷組織生長的影響Table 1 The effect of hygromycin on callus tissue growth

2.4 抗性愈傷的分化

將抗性愈傷接到預分化的培養基ZD3上，在此培養基中將ZT的濃度提至3.0 mg·L-1加速芽的誘導。抗性愈傷剛開始時為白色，在預分化的過程中逐漸變成綠色，當愈傷開始變成紅褐色時，開始分化出芽（圖2-D）。此時再將愈傷接到分化培養基ZD上，此培養基降低ZT的濃度至1.0 mg·L-1，不影響芽的分化和生長[5-7]。因為有研究證明在植物體內積累過高的ZT將影響后期根的分化[8]。

2.5 生根培養基對獼猴桃抗性植株生根的影響

在實驗中，將IBA和6-BA，分別設成不同的濃度，米良一號在5種培養基中均能誘導出根。當IBA的濃度達到1 mg·L-1時，由于生長素濃度過高，芽的底部很容易誘導出愈傷，而且愈傷的生長速度很快，雖然也能長出根來，但由于愈傷過大，根的生長受到嚴重的抑制，上面的芽的活力也比較低，生長的很慢，甚至還會出現落葉的現象。當在其中添加一定濃度的6-BA時，芽的生長狀況明顯比沒加時要好，但卻對根的生根沒有任何促進作用。當降低IBA的濃度后，愈傷的生根變慢，但還是有一小塊愈傷被誘導出來，根的誘導率有明顯的提高。隨著IBA濃度的降低，平均每個芽誘導出來根的數目和根的生長速度也相應降低[9-11]。因此最終我們選擇1/2 MS + 0.7 mg·L-1IBA + 0.15 mg·L-16-BA為米良一號的生根培養基。將長至3 cm左右的芽接到YR培養基上，20 d左右即可成功誘導出根，米良一號根的誘導比較容易，且根比較粗狀，但生根的數量不多，平均每個芽10條根左右（圖2-E）。

表2 植物生長調節劑對不定芽生根的影響Table 2 The effects of betanaphthoxy acetic acid on rooting

2.6 練 苗

獼猴桃的葉片較大，水份的蒸發量較高，如果直接將組培得到的再生苗種在自然環境中會因為失水而存活率不高。本實驗中將米良一號再生苗開蓋3 d后，種在小花盆中，先將其放在有蓋且透光性較好的置物箱中，以防水份蒸發過快。等其恢復生長后再逐步將其釋放到環境中去，存活率可達到90%以上（圖2-F）。

2.7 抗性植株的PCR檢測

經過轉化獲得29株潮霉素抗性植株，隨機選取其中14株提取基因組DNA，進行PCR擴增，結果其中有10株擴出目的條帶，為陽性植株，陽性植株率為71%，如圖3為14株抗性植株ACC氧化酶基因的PCR檢測結果，575 bp大小為目的條帶，結果顯示抗性植株中10株的擴增片段大小與陽性對照的條帶一致，而陰性對照(水和非轉基因米良一號植株)沒有目的條帶，證明目的基因已整合到轉化米良一號的基因組中。

圖3 轉化植株的PCR分析Fig.3 PCR analysis of transformed plants

泳道1為D2000 ladder marker；泳道2為無模板陰性對照；泳道3為未轉化米良一號的DNA PCR擴增陰性對照；泳道4為質粒的PCR擴增陽性對照；泳道5～18為待檢測的樣品DNA的PCR擴增產物(目標片斷的大小為575 bp)。

3 結論與討論

農桿菌介導轉化法是一個細菌和愈傷組織共同作用的復雜過程。凡是涉及到細菌活性或愈傷組織狀態的因素都可能影響轉化效果。對米良一號而言，一方面是愈傷分化較難，另一面是潮霉素篩選時對愈傷組織造成傷害，潮霉素濃度過高時愈傷完全不能生長。篩選時培養基中合適的潮霉濃度是篩選成功的關鍵所在。目前仍未見農桿菌介導米良一號轉化的報道。通過本實驗的研究，找到合適的誘導、繼代、分化培養基并優化了生根條件，為農桿菌介導轉基因獼猴桃提供合適的組培體系。另一方面，本實驗通過對潮霉素濃度的摸索，找到了一個適合用于米良一號篩選的潮霉素濃度，并對侵染時農桿菌的濃度，愈傷的處理以及共培養的條件等進行了優化且取得了較為理想的效果。本實驗以葉片和莖為外植體，首次采用農桿菌法成功轉化米良一號，為通過轉基因研究來改良米良一號奠定了基礎。

米良一號獼猴桃屬于多糖多酚類植物，多糖物質主要存在于葉中，葉片越老多糖含量越高，在DNA提取過程中，這些物質容易與DNA不可逆地粘附在一起而污染DNA，從而抑制DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶等多種分了生物學酶類的活性[10]，傳統的CTAB法、SDS法等都很難達到要求[12-14]，本實驗中我們采用CTAB區室法提取米良一號獼猴桃葉片中的基因組DNA，并對其進行一定改進使所得到的基因組DNA能夠滿足PCR鑒定和Southern印跡雜交要求。

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Establishment of transformation system of Kiwifruit Miliang-1

TIAN Hong-xian1,2, YUAN Ping2, WANG Man-ling3, LIU Yi2, LI Jing2, XIA Xin-jie3, TAN Xiao-feng1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Jishou University, Jishou 416000, Hunan,China; 3. Institute of Subtropical Agriculture eology, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, Hunan, China)

In order to establish the technology platform for function analysis of genes and genetic improvement of kiwifruit through biotechnology, the leaves and stems of Miliang-1 plants were used as explants. An efficient regeneration system was established for gene transformation by optimizing the culture medium. By using Agrobacterium-mediated method, transgenic plants containing the ACO(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase) gene fragment were successfully obtained. The results show that the TD medium was the efficent medium for callus induction with a rate of 100%. After three times of subcultures, calli were moved into the differentiation medium, and the rate of differentiation was 90%. A total of 29 hygromycin resistant plants were obtained, and 14 of them were chosen randomly for PCR analysis. Ten of the analyzed plants were shown to be positive for the ACO gene insert (71.4 % ).

Actinidia deliciosa (A. Cher.) (kiwifruit)；Agrobacterium tumefaciens；transformation system；tissue culture

S663.4

A

1673-923X(2012)08-0081-05

2012-01-24

湖南省省級科技計劃(專項計劃）項目“耐貯保鮮高抗性轉基因獼猴桃的研究和開發”（2008JT3008)；湖南省高校產學研合作示范基地開放項目（2011jsjk003）

田宏現（1953—），男，湖南保靖人，教授，碩士生導師，博士生，主要從事微生物學和林業生物技術方面的研究。E-mail：jstianhx@163.com

譚曉風（1956—），男，湖南茶陵人，教授，博士生導師，博士，主要從事經濟林和林業生物技術研究；E-mail：tanxiaofengcn@126.com.cn；夏新界（1959-），男，博士，研究員，博士生導師，主要研究方向為作物耐逆分子生物學；E-mail：jxxia@isa.ac.cn

[本文編校：吳 彬]