蛹蟲草菌的液態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)化

牛帥科楊自潔李 艷，2

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

蛹蟲草菌的液態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)化

牛帥科1楊自潔1李 艷1，2

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草菌的液態(tài)培養(yǎng)基，以獲得最大菌體量為響應(yīng)值，采用Plackett－Burman試驗篩選出主要影響因素為葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂。再利用最陡爬坡試驗確定響應(yīng)區(qū)域的中心點。最后利用中心復(fù)合試驗確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配方為葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.720g/L，七水硫酸鎂2.195 2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L。蛹蟲草菌的最終菌體總干重為3.91g/L，比優(yōu)化前增加了2.48倍。

蛹蟲草菌；培養(yǎng)基；液態(tài)發(fā)酵

蛹蟲草菌，又稱北冬蟲夏草，是一種名貴的藥用真菌。蛹蟲草菌含有多種有效成分，包括核苷類化合物（又稱蟲草素）、蟲草多糖、蟲草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、維生素及微量元素等7大類具有生物活性和藥理作用的化合物［1］。這些有效成分可以增強(qiáng)人體免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效［2］。目前市場上銷售的冬蟲夏草人工替代品主要是通過3類方法培育的蛹蟲草菌：① 用鮮或干蠶蛹體培植出的蛹與草為一體的“蛹體蟲草”；② 以大米、小麥等為主要原料，在固態(tài)人工合成培養(yǎng)基上培植出的“蟲草菌子實體”；③ 采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲體。在藥化、藥理和臨床試驗［3］均證明它們的主要有效成分可替代天然的冬蟲夏草。對蛹蟲草菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)大量生產(chǎn)菌絲體，比固態(tài)培養(yǎng)蛹蟲草菌子實體具有周期短、可控性強(qiáng)、功能性有效成分含量高等優(yōu)點，且利于大規(guī)模生產(chǎn)［4，5］。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草菌的生長受培養(yǎng)基組成的影響，培養(yǎng)基內(nèi)碳源、氮源和無機(jī)鹽等各種物質(zhì)的加量與配比，及其各種物質(zhì)間的交互作用對菌體生長和得量都有直接的影響。本試驗利用響應(yīng)面法，對液體培養(yǎng)蛹蟲草菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，目的是獲得菌體最大量的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

蛹蟲草菌（cordyceps sinensis）KDLMH01：由本實驗室保藏；

出發(fā)菌株：衡水鹿鳴春蟲草科技開發(fā)有限公司。

1.1.2 試驗儀器與藥品

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－0AB型，天津泰斯特儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ－LS－50SII型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

葡萄糖、蛋白胨等：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

原始培養(yǎng)基組成：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，自然pH 值。

1.3 培養(yǎng)過程

1.3.1 菌種活化 將冰箱保存的斜面菌種劃線接入于固態(tài)PDA培養(yǎng)基平板中進(jìn)行活化培養(yǎng)，25℃靜置培養(yǎng)48h。

1.3.2 種子培養(yǎng) 切取0.5cm2平板活化菌種接入原始種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)種子培養(yǎng)，25℃靜置培養(yǎng)3d。

對患者實施無陪護(hù)護(hù)理前、3個月后危險事件發(fā)生率以及焦慮情緒進(jìn)行對比，其中焦慮情緒通過漢密爾頓焦慮量表（HAMA）給予評估，總分29分，分值越高表明焦慮情緒越嚴(yán)重。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將種子培養(yǎng)液按照12.5μL/mL的接種量接種于響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計的各個液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，25℃，自然pH值，靜置培養(yǎng)9d。

1.4 生物量檢測方法

蛹蟲草菌生長及生物量的檢測采用菌絲體干重法，即定時取樣，真空抽濾，90℃烘干2h稱重，以濾紙抽濾后和抽濾前的干重差值為菌絲體干重。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

1.5.1 主要影響因素的確定 設(shè)計Plackett－Burmen試驗，對4因素2水平進(jìn)行考察。以原始培養(yǎng)基組成含量設(shè)為0，高水平編碼1，低水平編碼－1，用minitab軟件進(jìn)行最終數(shù)據(jù)的處理。以0點的0.5倍為－1水平，0點的1.5倍為＋1水平，詳見表1。

表1 PB試驗設(shè)計的試驗因子和試驗水平Table 1 The experiment factor and the experiment level of PB experiment design /（g·L－1）

1.5.2 最陡爬坡試驗確定中心點 根據(jù)Plackett－Burmen試驗結(jié)果，決定爬坡的方向及步長，確定出中心復(fù)合試驗的中心點。

1.5.3 中心復(fù)合試驗 使用 Minitab軟件設(shè)計3因素3水平中心復(fù)合試驗。確定最優(yōu)培養(yǎng)基配比。

1.5.4 驗證實驗 使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方與原始培養(yǎng)基配方進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵對比試驗、接種量、培養(yǎng)溫度和時間等見1.3.3。以菌絲體干重為響應(yīng)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 主要影響因素的確定

按照Plackett－Burmen兩水平法設(shè)計次數(shù)為N＝4試驗，對葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個因素進(jìn)行考察，響應(yīng)值為菌絲體干重，目的是為了篩選出影響菌體生長的主要影響因素，Plackett－Burmen試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。對Plackett－Burmen試驗結(jié)果分析見表3。

由表3可知，各因素的影響程度依次是A＞B＞C＞D，A和B的P值小于0.05，屬于顯著影響因素；決定系數(shù)R2＝92.55%，表示該試驗結(jié)果良好。最終確定顯著因子A、B、C 3個因素，即葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂進(jìn)行最陡爬坡試驗。

表2 PB試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results for PB experiment

表3 PB試驗結(jié)果分析Table 3 The result analysis of PB experiment

2.2 中心點的確定

為了得到中心復(fù)合試驗的中心點，需要利用最陡爬坡試驗確定，根據(jù)Plackett－Burmen試驗結(jié)果可知葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂3個影響因素的T＞0，屬于正向影響，如果要提高響應(yīng)值，則需要提高此三因素的濃度。初始濃度分別為20，5，0.5g/L。最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

由表4可知，前期隨著葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂濃度的增加，菌體量有所增加，說明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂的增加對菌體的增量有明顯的正影響。到第7組樣開始降低，原因可能是高含量的葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂使培養(yǎng)基的滲透壓提高，超過了該菌的耐滲透壓極限，導(dǎo)致菌體量下降。第6號樣是爬坡試驗的頂點，即為中心復(fù)合試驗的中心點，葡萄糖（A）、蛋白胨 （B）、七水硫酸鎂（C）的最優(yōu)濃度分別為60，20，2g/L。由此點進(jìn)行中心復(fù)合試驗。

表4 爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and data from the steepest ascent experiment

2.3 中心復(fù)合試驗

以Plackett－Burmen試驗得到的 A（葡萄糖）、B（蛋白胨）、C（七水硫酸鎂）為主要影響因素，爬坡試驗得到的中心點，進(jìn)行中心復(fù)合試驗。設(shè)計A、B、C的步長分別為10，4，0.5g/L。5個水平分別為－1.68，－1，0，1，1.68。中心復(fù)合試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，分析結(jié)果見表6。

表5 中心復(fù)合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results from central composite experiment

表6 中心復(fù)合試驗結(jié)果分析+Table 6 Result analysis of composite experiment

該中心復(fù)合試驗中心點針對3個變量5個水平總共做了18組試驗，由表6可知，t值表示各因素的顯著性影響，正負(fù)表示的是各個因素的影響方向。而P值大小也是作為檢驗各個因素的顯著性影響大小的標(biāo)尺，P值越低則表示其影響越顯著，若P值小于5%則認(rèn)定為顯著影響因素［6，7］。可以看出表6中的因素：A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC、BC，其中除C、BC以外，包含7個顯著項。基于表6中各個因素的系數(shù)可以創(chuàng)建二次回歸多項式方程：

R2的大小可以解釋此模型是否擬合試驗結(jié)果，本試驗?zāi)Ｐ蜎Q定系數(shù)為R2＝95.2%，此決定系數(shù)是通過試驗中單因素和各個因素間交互作用的結(jié)果來說明此響應(yīng)面結(jié)果具有多大的可變性。校正后的R2為89.8%，說明該模型與試驗結(jié)果擬合度較好，試驗誤差較小，所以模型是合適的，可以將模型用于分析蛹蟲草菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［8，9］。

2.4 響應(yīng)面分析與最優(yōu)培養(yǎng)基配方的確定

根據(jù)表5中的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Minitab系統(tǒng)軟件繪制響應(yīng)曲面圖進(jìn)行嶺脊分析［10］，應(yīng)用 Minitab軟件繪制響應(yīng)曲面圖，可以直觀的反映出各因素對響應(yīng)值影響的變化趨勢，每張圖表示固定其中一個因素，另外兩個因素之間的交互作用。各個因素間的嶺脊分析見圖1～3。

由圖1可知，葡萄糖和蛋白胨作為變量，七水硫酸鎂作為固定量，可以從圖中直觀的看到當(dāng)葡萄糖量在0附近時，蛋白胨在0至1內(nèi)此響應(yīng)面達(dá)到最高點。圖1～3皆表明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂的濃度在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)，呈現(xiàn)較好的結(jié)果。

利用Minitab軟件優(yōu)化器繪制響應(yīng)面優(yōu)化圖得到最優(yōu)結(jié)果：A：0.764 5、B：1.681 8、C：0.390 7，換算為實際含量：葡萄糖為53.363 6g/L，蛋白胨為26.720g/L，七水硫酸鎂為2.195 2g/L時是響應(yīng)面的頂點，為最優(yōu)結(jié)果。得到的理論菌體干重為4.157 5g/L。按照此配方最終得出實際菌體干重為3.910 0g/L接近理論值，優(yōu)化后的培養(yǎng)基理論上與未優(yōu)化前的1.517g/L相比可以提高2.74倍的產(chǎn)量，實際提高了2.48倍。

圖1 葡萄糖濃度與蛋白胨濃度的響應(yīng)面立體分析Figure 1 The Response surface analysis of glucose’s concentration and peptone’s concentration

圖3 蛋白胨濃度與七水硫酸鎂濃度的響應(yīng)面立體分析Figure 3 The Response surface analysis of MgSO4·7H2O’s concentration and peptone’s concentration

3 結(jié)論

蛹蟲草作為藥品、保健品、食品添加劑等物質(zhì)，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和開發(fā)前景，但天然的蛹蟲草來源稀少，并且天然蟲草菌中的核苷類物質(zhì)與人工養(yǎng)殖相比較少［11］，這就使得人工培育特別是液態(tài)深層培養(yǎng)蛹蟲草成為熱點［12］。通過對蛹蟲草菌液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究，最終確定了最佳培養(yǎng)基比例為葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.72g/L，七水硫酸鎂2.195 2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L。經(jīng)過優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)量與優(yōu)化前相比菌體量提高了2.48倍，且此試驗重現(xiàn)性較高，為大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲草奠定了基礎(chǔ)。

1 廖春麗，方改霞，王蓮哲，等.蛹蟲草主要有效成分分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（12）：5 050～5 052.

2 蔣寧，劉紅錦，劉芳，等.蟲草菌素研究與開發(fā)的現(xiàn)狀與前景［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23（1）：121～123.

3 李玉玲，劉欣，許海峰，等.青海冬蟲夏草的研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢［J］.青海科技，2002（4）：15～17.

4 肖洪亮，高孔榮，譚盈科，等.冬蟲夏草及其菌絲體研究進(jìn)展［J］.中國食用菌，1996，16（2）：3～5.

5 潘新群，左曉林，董華興，等.蛹蟲草菌液體發(fā)酵工藝的研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，18（1）：30～34.

6 Sarkar Mannan，Ahmadun Fakhru，Md Zahangir Alam.Optimization of process parameters for the bioconversion of activated sludge by Penicillium corylophilum，using response surface methodology［J］.Journal of Environmental Sciences，2007（19）：23～28.

7 Zeng Xiaobo，Wang haiying，He Linyu，et al.Medium optimization of carbon and nitrogen sources for the production of eucalyptene A and xyloketal A from Xylaria sp.2508using response surface methodology［J］.Process Biochemistry，2006（41）：293～298.

8 Ashima Vohra，T Satyanarayana.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala［J］.Process Biochemistry，2002（37）：999～1 004.

9 Aakel，M Ersan，Y Sag Aakel.Optimization of critical medium components using response surface methodology for lipase production by Rhizopus delemar［J］.Food and Bioproducts Processing，2010（88）：31～39.

10 湯蕾，余曉斌，郝學(xué)財，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蟲草液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品與機(jī)械，2005，21（6）：41～43.

11 彭日煌，謝明勇，王遠(yuǎn)興，等.RP－HPLC測定蟲草菌粉中核苷類成分［J］.食品與機(jī)械，2005，21（1）：61～63.

12 連云嵐，楊中林.北蟲草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2006，35（1）：44～46.

Optimization ofcordyceps sin en sisliquid medium by response surface method

NIU Shuai－ke1YANG Zi－jie1LI Yan1，2

（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，
Shijiazhuang，Hebei050018，China；2.R＆D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei050018，China）

This experiment used the response method to optimize the liquid medium ofcordyceps sinensis，inorder to get the biggest mycelia weight.The Plackett－Burman experiment screened out the main influence factors：glucose，peptone and magnesium sulfate.Then the path of the steepest ascent was utilized to approach the point of the optimal region.At last，the central composite experiment was done to determine the optimal formula of the medium：glucose 53.363 6g/L，peptone 26.720g/L，MgSO4·7H2O 2.195 2g/L，KH2PO40.5g/L.And the dry weight ofcordyceps sinensiswas 3.91g/L，to compare with the initial increased 2.48times.

cordyceps sinensis；medium；liquid fermentation

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.054

河北省石家莊市科技支撐計劃（編號：10117901A）

牛帥科（1987－），男，河北科技大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：nskice＠126.com

李艷

2011－12－01