基于SRAP的贛南油茶良種分子鑒別研究

韓 欣，張黨權，王志平，宋志丹，谷振軍，王金路，鄺先松，田曄林

基于SRAP的贛南油茶良種分子鑒別研究

韓 欣1，張黨權1，王志平2，宋志丹1，谷振軍1，王金路1，鄺先松3，田曄林4

(1.中南林業科技大學 a.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.林業生物技術湖南省重點實驗室；c.長沙市經濟林工程技術研究中心，湖南 長沙 410004；2.撫州市林業科學研究所，江西 撫州 344000；3.贛州市林業科學研究所，江西 贛州 341000；4.北京農學院 園林學院，北京 102206)

油茶是我國南方的主要木本食用油料樹種，贛南油茶良種是我國重要的油茶資源組成部分。利用SRAP（序列相關擴增多態性）標記技術，對我國油茶良種分子鑒別進行探索性研究。以14個贛南油茶良種為對象，提取葉片基因組DNA作為模板，篩選出穩定性高的引物組合; 采用SRAP-PCR的優化反應體系，對獲得的清晰可重復的條帶進行{0,1}數據轉換，并根據SRAP的譜帶特征建立了贛南油茶良種的分子鑒別體系，為油茶良種的分子鑒定提供了理論依據和技術基礎。

贛南油茶；分子鑒別；SRAP；良種

油茶Camellia oleifera又名茶子樹、油茶樹，是山茶屬植物中油脂含量較高且具有栽培經濟價值的一類植物的總稱[1]，是我國特有的食用木本油料樹種，主要分布在湖南、江西、廣西等地。油茶適應力強，是我國南方低山和丘崗地區開發的主要經濟林樹種之一[2]。從油茶種仁中制備的茶油是一種高品質純天然植物食用油，而茶枯和茶殼還可用于工業和醫藥原料。我國研究人員對油茶科學進行了長期的研究，在良種培育、豐產栽培、病蟲害防治等方面取得了豐碩的研究成果，但在分子遺傳學方面還處于起始階段[3]。

DNA分子標記技術被廣泛應用于林木遺傳學研究[4]。近年來，一種基于外顯子與內含子、啟動子序列差異的新型分子標記技術——SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態性）[5]，其原理是通過獨特的引物設計，對目的基因組DNA的開放閱讀框進行擴增[6]。由于SRAP所獲得的多態性DNA條帶大部分是與基因表達相關[7]，因而特別適用于不同良種之間的分子遺傳學研究[8]。SRAP的正向引物（長度為17 bp）由5′端的填充序列和3′端CCGG序列組成核心序列，3′端再設計3個選擇性堿基對外顯子進行特異性擴增[9]。SRAP的反向引物（長度為18 bp）5′端前11 bp為填充序列，與后面的AATT組成核心序列，3′端亦連接3個選擇性堿基，對內含子區域、啟動子區域進行特異性擴增[10]。因此，SRAP標記的擴增產物因不同物種、不同基因型的內含子、啟動子與間隔長度不等而產生穩定的多態性[11]。因而，SRAP分子標記技術特別適用于不同種質特異性狀遺傳多樣性及性狀相關差異標記的研究[12-13]。

從20世紀60年代末開始，江西贛南地區系統開展了贛南油茶選優和良種培育的科學研究[14]。經數十年努力，先后選育出“GLS贛州油”、“GLR贛州油”等20多個油茶良種，其中，“GLS贛州油”是國家林木品種審定委員會審定的國家級良種，“GLR贛州油”是江西省林木品種審定委員會審定的林木良種，以及部分認定的油茶豐產良種[15]。多年來推廣栽培證明，用這些贛南油茶良種造林，豐產期平均畝產茶油可達50 kg，最高達67.25 kg，為國內較優的油茶良種。將這些新品種、新技術應用于生產，有著巨大的經濟、生態和社會效益[16]。

然而，目前油茶良種的形態標記極少[17]，而且，即使可通過形態標記對林木進行初步鑒定，但當葉片、枝條、種子等材料脫離油茶植株個體后，良種無性系或種源在形態上很難區別，時常出現假冒良種，對油茶產業造成較大損失，制約了我國油茶良種化的進程，不利于油茶產業的又好又快發展。因而，需開發新型分子標記對贛南油茶良種進行離體材料的有效、快捷、準確鑒定[18]。本研究采用SRAP分子標記技術，以油茶葉片為材料，提取基因組DNA為模板，探索油茶良種的分子鑒別技術體系，可為油茶良種的推廣栽培和分子標記輔助選擇育種提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基于Li and Quiros (2001)提出的SRAP引物設計原則[5]，從16個SRAP正向引物和20個SRAP反向引物中，篩選出多態性好、條帶特異、穩定性高的8對引物組合（見表1），由深圳華大基因科技有限公司合成。

采取江西省贛州市林業科學研究所、撫州市林業科學研究所提供的14個油茶高產優良品種（見表2）的新鮮葉片，洗凈后于-70℃冷凍保存備用。所用試劑都為分子生物學純。

表1 SRAP標記8對引物組合的正反引物序列Table 1 Sequences of SRAP forward and reverse primers for 8 groups

表2 贛南油茶14個良種及序號Table 2 The14 elite varieties of Camellia oleifear and their number

1.2 油茶基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[19-20]提取贛南油茶葉片的基因組DNA，即采集足量的油茶嫩葉，抽提時加入β-巰基乙醇，抽提過程中使用2.5%CTAB，最后用預冷的無水乙醇沉淀DNA，溶解后稀釋至10 ng/μL，于零下20℃保存備用。

1.3 SRAP-PCR體系

本實驗采用優化的SRAP-PCR反應體系[10,18]進行擴增，PCR反應總體積為20μL，循環程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增結果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 SRAP-PCR的數據處理

采用8對引物組合對14個油茶良種的模板DNA進行SRAP-PCR擴增。按照相同遷移位置上有擴增條帶記為“1”、無則記為“0”的方法記錄每個引物的電泳譜帶，且僅記錄清晰、重復性好的擴增條帶，并將“1”、“0”數據轉化成基因型數據，用于后續的分子鑒別分析。

2 結果與分析

2.1 油茶良種的8對SRAP引物組合擴增結果

通過改良CTAB法提取了高質量的贛南油茶14個良種葉片基因組DNA，采用8對SRAP引物組合進行PCR擴增，獲得了22條多態性條帶，長度范圍150～1 200 bp（見圖1）。

圖1 贛南油茶14個良種的8個引物組合的SRAP-PCR擴增結果Fig.1 SRAP-PCR results of 14 elite C.oleifera cultivars by using 8 primer groups

2.2 贛南油茶良種的基因型及分子鑒別

根據SRAP引物的擴增圖譜，繪制了油茶14個良種的分子標記基因型｛0,1｝數據表（見表3）。根據特異分離譜帶確定了個品種的標記基因型，以此實現對油茶14個良種DNA水平上的鑒別。

表3 贛南油茶14個良種的分子鑒別0-1基因型數據Table 3 The 0-1 genotype data for molecular identification of 14 Camellia elite cultivars from south Jiangxi province

1號樣品的特征譜帶組合是ME4-EM6-800bp，ME4-EM6-620bp，ME5-EM1-300bp，ME4-EM5-320bp。2號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-670bp，ME5-EM1-620bp。3號樣品的特征譜帶組合 是 ME1-EM5-1200bp， ME1-EM5-880bp， ME1-EM8-300bp， ME2-EM3-350bp， ME3-EM3-350bp，ME4-EM5-320bp。4號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-1200bp，ME1-EM5-880bp，ME1-EM8-300bp，ME4-EM6-800bp，ME4-EM6-400bp， ME5-EM1-250bp。5號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-880bp，ME1-EM5-670bp，ME1-EM8-300bp，ME2-EM3-800bp，ME2-EM3-350bp， ME5-EM1-300bp，ME5-EM1-620bp。6號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-670bp，ME4-EM6-800bp，ME4-EM6-400bp，ME2-EM3-800bp， ME4-EM2-650bp。7號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM8-300bp，ME4-EM6-800bp，ME2-EM3-900bp，ME2-EM3-800bp，ME2-EM3-350bp，ME5-EM1-800bp，ME3-EM3-700bp，ME4-EM5-250bp，ME3-EM3-700bp。8號樣品的特征譜帶 組 合 是 ME1-EM5-1200bp，ME1-EM5-670bp，ME1-EM8-300bp，ME2-EM3-550bp，ME2-EM3-350bp，ME4-EM5-320bp。9號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-670bp，ME2-EM3-680bp，E4-EM2-650bp，ME4-EM5-250bp。10號樣品的特征譜帶組合是 ME1-EM5-670bp，ME4-EM6-400bp，ME2-EM3-900bp，ME2-EM3-800bp，ME5-EM1-800bp，ME4-EM2-650bp。11號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-670bp，ME2-EM3-900bp，ME2-EM3-800bp，ME2-EM3-680bp，ME2-EM3-350bp。12 號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-880bp，ME1-EM5-670bp，ME2-EM3-900bp，ME2-EM3-800bp，ME2-EM3-680bp。13號樣品的特征譜帶組合是ME2-EM3-900bp，ME2-EM3-680bp，ME2-EM3-550bp，ME2-EM3-350bp，ME5-EM1-250bp，ME5-EM1-800bp。14號樣品的特征譜帶組合是ME1-EM5-670bp，ME2-EM3-900bp。

其中，ME4-EM6-620bp為1號樣品特有的特征條帶，ME5-EM1-250bp為4號樣品特有的特征條帶，ME3-EMs3-350bp為3號樣品特有的特征條帶，ME3-EM3-700bp為7號樣品特有的特征條帶，ME4-EM2-150bp為12號樣品特有的特征條帶，可以作為簡單鑒別依據。

3 結論與討論

采用優化的SRAP-PCR反應體系，對贛南14個油茶良種進行了SRAP-PCR分析，從16個正向引物和20個反向引物中篩選出條帶特異、多態性好、穩定性高的8對引物組合。利用這些引物組合對贛南油茶14個良種擴增出22條多態條帶，并轉換成｛0,1｝基因型數據，初步建立了這些油茶良種的分子鑒別體系。

20世紀90年代以來，國內外許多研究者已將RAPD、ISSR、SSR等分子標記應用于農作物（如水稻、小麥等）、果樹（如蘋果等）、林木（如楊樹、桉樹等）和園林花卉（如月季、菊花等）的品種分子分類和分子鑒定[21]，這些研究均以譜帶的差異作為鑒別的依據[22]。而SRAP是基于外顯子與內含子、啟動子序列差異的一種新型分子標記技術，通過獨特的引物設計對開放閱讀框進行擴增，所獲得的多態性DNA條帶大部分是與基因表達相關，因而比RAPD、ISSR等標記更適用于不同良種之間的分子遺傳學研究[23]，特別是在油茶遺傳圖譜構建、油茶數量性狀位點定位、分子標記輔助選擇育種、綜合圖譜構建和基因圖位克隆提供有效的框架，為其它相關分子遺傳學研究提供有益參考。

目前，可應用于油茶優良種質分子鑒別研究的SRAP引物較少，因而還需加大引物開發力度[24]。作為隨機引物標記的一種，SRAP的穩定性不如特異引物標記如SSR[25]，因而，需繼續進行將SRAP標記開發成高穩定性的SRAP-SCAR特異標記，以實現我國油茶良種的精準分子鑒定，從分子水平上提升我國油茶良種化進程。

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SRAP-based molecular identification of elite cultivars of Camellia oleifera from south Jiangxi province

HAN Xin1, ZHANG Dang-quan1, WANG Zhi-ping2, SONG Zhi-dan1, GU Zheng-jun1, WANG Jin-lu1, KUANG Xian-song3, TIAN Ye-li4
(1 a.Key Lab.of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration; 1b.Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology; 1c.Non-wood Engineering Institute of Changsha; Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.Fuzhou Forestry Research Institute, Fuzhou 344000, Jiangxi, China; 3.Ganzhou Forestry Research Institute,Ganzhou 341000, Jiangxi, China ; 4.School of Landscape Architecture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Camellia oleifera is one of main tree species of woody edible oil in South China, and important elite cultivars resource in southern Jiangxi province.The researches on molecular identification of the elite cultivars in south Jiangxi were carried out by SRAP(sequence related amplification polymorphism).By Using the leaf genomic DNA extracted from 14 elite Camellia oleifera cultivars in south Jiangxi province, the improved CTAB method as template, the high-stable primer groups were selected out based on the improved SRAP-PCR system, which can bring specific DNA bands, good polymorphism and high stability.According to the SRAP-based band pattern from these primer groups, the polymorphic DNA bands were transformed in range of {0,1} data, which was used to establish the primary system of molecular identification of elite cultivars from south Jiangxi, thus providing theoretic basis and technique foundation of molecular identification of Chinese elite Camellia oleifera cultivars.

Camellia oleifera; molecular identification; SRAP; elite cultivars

S794.4

A

1673-923X(2012)03-0147-05

2011-10-20

國家“十一五”科技支撐計劃課題（2009BADB1B02，2009BADB1B10）

韓 欣(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為植物分子遺傳學

張黨權(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為植物分子生物學與林產品加工利用；E-mail：zhangdangquan@163.com

[本文編校：謝榮秀]