雙江古茶樹與云南大葉種茶群體品種間的ISSR分析

吳 田，沈曉進 ，李法營 ，韋玲長 ，藍增全

雙江古茶樹與云南大葉種茶群體品種間的ISSR分析

吳 田1，沈曉進2，李法營3，韋玲長4，藍增全3

（1.西南林業大學 園林學院，云南 昆明 650224；2.昆明市農科院生物所，云南 昆明 650034；3.西南林業大學 環境科學與工程學院，云南 昆明 650224；4.臨滄茶葉科學研究所，云南 臨滄 677000）

采用ISSR分子標記技術對云南17份茶樹樣品進行了親緣關系分析。實驗結果表明，12條ISSR引物共產生193條擴增帶，其中多態性條為100.0%。供試材料的遺傳相似系數變異范圍為0.50～0.88。通過UPGMA法，可將17份材料分為2個大類，第1大類為“紅毛茶”，第2大類又可分成2個亞組，其中組Ⅰ包括雙江古茶樹和永德大葉種，而組Ⅱ包括勐庫群體品種、勐海大葉種和部分鳳慶大葉種。聚類分析結果表明，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關系最近，而與采自勐海和鳳慶大葉種的親緣關系相對較遠。

大葉茶；種質資源；ISSR標記

云南大葉種茶是云南省大葉類茶樹品種的總稱，其代表是經國家認定的勐庫大葉種、鳳慶大葉種和勐海大葉種。據國家、省、地茶葉學者專家科考組2002年12月的初步結論，樹齡2 700多年的雙江自治縣勐庫野生古茶樹群落，是迄今世界上已發現的海拔最高、分布面積最廣、種群密度最大的野生古茶樹群落。其中，1號大茶樹位于海拔2 720 m處，株高16.8 m，基圍3.25 m，胸圍3.1 m，樹幅13.7×10.6 m；另外一棵根基和株高都在1號大茶樹之上的古茶樹，因為這棵茶樹是在考察組對古茶山科考后才發現的，先前就命名了1號大茶樹，所以，便稱它為 1+1號大茶樹。近年來，雖然有不少報道是關于茶樹親緣關系的研究，但鮮有探討雙江古茶樹與云南大葉群體品種間親緣關系的的研究。

隨著分子生物學的發展，基于PCR的分子標記如RAPD、AFLP 、SSR、ISSR等，被廣泛應用于植物遺傳研究[1-2]。ISSR 標記是采用17～22堿基的重復錨定引物擴增重復序列之間的片段，操作簡單、重復性好、多態性豐富[3]，且一套ISSR引物可在多種作物中通用，利用率高，在遺傳關系研究方面的應用前景更廣闊[4]。用ISSR標記進行茶樹進行分子鑒別的報道逐漸增多[5-7，8]。本實驗采用ISSR技術探討雙江古茶樹與云南大葉群體品種間的親緣關系，以在今后育種及分類工作中在DNA水平提供證據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

樣品主要采集自勐庫、鳳慶、勐海等3個茶區，葉面積、葉形指數、葉脈數、葉片特點、葉片顏色等特征詳見表1。表1中的名稱大多根據采集地命名，如“勐庫”為勐庫群體栽培品種，采集自勐庫；“鳳慶1”、“鳳慶2”分別為采集自鳳慶不同地點的兩份材料。古茶樹1～4均采自雙江勐庫鎮大雪山，其中“古茶樹2”為1號大茶樹，“古茶樹4”為1+1號大茶樹，而“古茶樹1” 和“古茶樹3”為1號大茶樹附近、植株較為矮小的、形態特征略有差異的茶樹樣品。古茶樹1、2、3和4即為本實驗所要探討的雙江古茶樹。而“紅毛茶”是當地認為是“野茶”的一種資源，且有研究者認為其與雙江古茶樹有一定的淵源，但目前還未見其進行詳細的分類鑒定的資料。樣品選無病蟲害的茶樹嫩葉，洗凈后擦干，用液氮速凍，置于-70℃冰箱備用。

表1 用于本研究的云南大葉種茶種質?Table 1 Yunnan big-leaf tea germplasm resources used in the present study

1.2 主要試劑

CTAB提取介質：200 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，l00 mmol/L EDTA(pH 值 8.0)，200 mmol/L NaCl；CTAB抽提緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 值 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，350 mmol/L NaCl，3 % CTAB，2% β-巰基乙醇；SDS提取介質：100mmol/L(pH8.0)Tris-HCl，50 mmol/L EDTA (pH值8.0)，500 mmol/L NaCl。本實驗所使用的試劑均為國產分析純。

1.3 DNA提取

本實驗用改良CTAB法提取DNA，即稱取保存于-70 ℃冰箱茶樹葉片于液氮中迅速研成粉末，取約0.2 mg轉入2.0 mL 離心管中，加入1 mL CTAB提取介質，混勻，7 000 r/min離心5 min，除去上清；重復上述操作；在沉淀中加入1 m L 65℃的CTAB抽提緩沖液，混勻，65 ℃水浴1 h；7 000 r/min離心10 min，取上清液，轉入另一離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，充分混勻，至水相由綠色變為無色；10 000 r/min離心10 min，取上清液，轉入另一離心管中，加入2倍體積-20 ℃預冷的無水乙醇，輕柔混勻；10 000 r/min離心10 min，將上清液緩慢倒出，用75%乙醇浸泡沉淀1 h后在超凈工作臺吹干至無酒精味，溶于適量1×TE緩沖液。

1.4 DNA檢測

取5 μL DNA樣品與3 μL上樣緩沖液(loading buffer)混勻后點樣于1% EB瓊脂糖膠孔，電泳，用凝膠成像系統照相，保存，以檢測DNA樣品的完整性。根據電泳檢測結果大致判斷DNA濃度，將DNA稀釋至合適倍數，用超微量分光光度計測定OD260/OD280、OD260/OD230和DNA樣品濃度，以檢測DNA樣品的純度和濃度。

1.5 ISSR引物篩選及ISSR-PCR擴增

根據加拿大British Columbia大學設計的ISSR引物序列，隨機選擇32條，由上海生工合成。PCR試劑均購自日本TAKARA公司。PCR反應液體系為20 μL，含10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(A、T、C、G) 各 200 μmol/L，每條引物 1 μL (10 mmol/L)，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 50 ng(提取自“紅毛茶”)，不足體積用無菌超純水補足。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；50 ～ 60 ℃（根據引物合成單上的Tm值分別試驗，取最佳退火溫度） 45 s；72 ℃ 1 min 30 s，40 個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物在1×TAE緩沖系統下用2.0%的加入溴化乙錠(EB)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳完畢后在美國UVP凝膠成像系統上照像并保存。每組引物重復3次，以確認易于辨認、清晰且重復性好的條帶。

1.6 數據分析

根據電泳條帶的有無統計數據，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0。只記錄易于辨認、清晰且重復性好的條帶，排除模糊不清的條帶。用NTsys 2.1e軟件對茶樹種質進行非加權組平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method Analysis)聚類分析，計算種質之間的遺傳相似系數，建立樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

本實驗采用改良CTAB法提取的云南大葉種茶樹葉片基因組DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖片未顯示)，結果顯示DNA主帶清晰明亮，條帶整齊，無拖帶現象。經紫外分光光度計檢測，DNA的OD260/OD280值在1.7～1.9之間， OD260/OD230值在1.9～2.1之間，表明該方法提取的總DNA質量比較高，純度好，可以用于后續ISSR分析。

2.2 ISSR引物的篩選

以“紅毛茶”基因組DNA為模板，對32條不同的隨機引物進行了PCR擴增(圖1)，發現有12條引物在相應的退火溫度下(表2)能擴增出產物，其中引物840、844、847、848、866、856、827擴增的條帶清晰，且多態性較高。

表2 用于本研究的ISSR引物Table 2 ISSR primers used in the study

圖1 ISSR引物篩選Fig.1 Selection of ISSR primers

2.3 不同大葉茶種的ISSR-PCR擴增

分別用12個引物對17份樣品進行ISSR-PCR擴增，結果表明擴增的條帶大部分集中在100～1 000 bp，可讀條帶數共193條，多態性比率為100.0%。圖2以引物847為例展示了其在17份樣品中擴增的圖片。

圖2 引物847的ISSR擴增Fig.2 Agarose gels showing the ISSR profile generated by primer 847

2.4 聚類圖的構建

采用UPGMA法構建了17份樣品的遺傳關系聚類圖(圖3)。通過聚類發現，17份樣品的遺傳相似系數變化范圍為0.50～0.88，其中紅毛茶單獨聚類，與其它16份種質的親緣關系較遠。其余的16份種質明顯聚為兩組(組Ⅰ和組Ⅱ)，組Ⅰ包括采集自勐庫的種質和部分采集自永德的種質，而組Ⅱ包括勐庫群體品種“勐庫”、采集自勐海的種質和采集自鳳慶的種質。特別值得注意的是，古茶樹1、2、3和4，即雙江古茶樹聚類較近，表明了它們較近的親緣關系。而雙江古茶樹與“勐庫”分別位于聚類圖的兩組中，且“勐庫”與鳳慶種親緣關系最近，暗示著勐庫群體品種并非源于當地。此外，通過聚類圖還可以發現，古茶樹1和古茶樹3遺傳距離最小，表明兩者之間親緣關系最近，且在本實驗所用標記范圍內、相似性系數為0.88時，這兩種種質在DNA分子水平上是相同的，表明單純從表觀性狀進行分類是有失偏頗的，更加暗示了分子技術在植物分類中的重要作用。總之，從聚類圖可見，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關系最近，而與采自勐海的大葉種樣本和鳳慶的樣本的親緣關系相對較遠。

3 討 論

圖3 17份茶樹種質的UPGMA聚類Fig.3 UPGMA-based analysis among 17 Yunnan big-leaf tea resources

本研究中12條ISSR引物被用于雙江古茶樹與云南大葉群體品種間的親緣關系分析，研究結果表明，16份云南大葉種茶樹及1份“紅毛茶”資源種質間DNA擴增譜帶的多樣性程度高達100%，這與劉本英[7]、邵婉芳[9]和段紅星[10]研究云南茶樹種質有相似結果。從聚類樹狀圖可以看出供試種質分為2個大類，第1大類為“紅毛茶”，第2大類又可分成2個組，組Ⅰ包括雙江古茶樹和永德大葉種，而組Ⅱ包括勐庫群體品種“勐庫”、采集自勐海大葉種和鳳慶大葉種。從聚類圖可見，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關系最近，而與采自勐海和鳳慶的大葉種樣本的親緣關系相對較遠。值得一提的是，“紅毛茶”與雙江古茶樹聚類較遠，這在分子水平為“紅毛茶”與雙江古茶樹之間較遠的親緣關系提供了證據。

聚類分析也表明，來自鳳慶和勐庫的樣本沒有與地域相對較近的永德樣本聚在一起，而與地域相對較遠的勐海樣本聚在一起，這主要可能因為茶樹是高度雜合體，且為異花授粉植物，在長期雜交演化的過程中產生了大量的不連續變異，而且長時間移種后新環境對種質的遺傳信息也可能發生一定影響。也不排除所采樣本屬于農業生產中勐海、鳳慶、勐庫三地引種栽培大葉種茶樹的因素。此外，本研究發現，通過ISSR技術進行聚類分析的結果與通過葉片大小、葉脈數等傳統植物學分類的結果不完全相同，暗示著分子生物學與茶樹表觀特征的結合更利于茶樹分類的真實性和科學性。

致謝：本次實驗的部分樣品由云南農業大學茶學院熊能和李雙榮同學采集，在此表示感謝！

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ISSR analysis between Shuangjiang ancient tea trees and Yunnan big-leaf tea trees

WU Tian1, SHENG Xiao-jin2, LI Fa-ying3, WEI Ling-chang4, LAN Zeng-quan3
(1.College of Horticulture and Gardening, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China;2.Biotechnology Research Institute, Kunming Academy of Agriculture Science, Kunming 650034, Yunan, China;3.Lincang Tea Research Institute, Lincang 677000, Yunan, China;4.College of Environment Science and Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China)

ISSR molecular markers were used to analyze the genetic polymorphism of 17 Yunnan big-leaf tea resources.The results show that 193 bands were amplified with 12 ISSR primers, and the polymorphic rate were 100.00 %.The genetic similarity of the materials varied between 0.50 and 0.88.The 17 materials were classified into 2 groups with UPGMA method, and the first group involed “Hongmao Tea”, and the second one included two subgroups.The subgroup Ⅰ included the Shuangjiang ancient tea trees and Yongde big-leaf, and the subgroup Ⅱ included “Mengku”, the Menghai big-leaf and parts of Fengqing big-leaf.The genetic relationship of the ancient tea trees from Shuangjiang and parts of Fengqing big-leaf tea was the closest, and that was more far relatively with Menghai big-leaf tea.

big-leaf tea; germplasm resources; ISSR marker

S794.9；S571.1

A

1673-923X(2012)03-0136-05

2011-12-30

國家林業局948項目(2011-4-45)；西南林業大學重點基金(110908)和西南林業大學“大型儀器設備共享基金”

吳 田(1980—)，女，山東青島人，副教授，博士，主要從事植物生物技術及分子生物學方面的研究；E-mail：461257271@qq.com

藍增全(1963—)，男，廣東梅縣人，教授，主要從事生態學和茶學方向研究；E-mail： 2351417655@qq.com

[本文編校：歐陽欽]