美國和日本核桃RAPD-PCR反應體系優化

趙 鵬 ，Keith E.Woeste，張存旭 ，程 飛 ，張碩新，蔡 靖

美國和日本核桃RAPD-PCR反應體系優化

趙 鵬1,2,3，Keith E.Woeste2，張存旭1，程 飛1，張碩新1,4，蔡 靖1,4

（1.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100 ；2.美國普渡大學 森林與自然資源系，美國農業部闊葉樹種改良與更新中心， 西拉法葉市 印第安納州 47907，美國；3.西北大學 生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，陜西 西安 710069；4.陜西秦嶺森林生態系統國家野外科學觀測研究站，陜西 寧陜 711600）

核桃屬種質資源豐富，其中多數物種木材材質優良，果實可食，營養豐富，為重要的經濟樹種。以美國白核桃Juglans cinerea、日本核桃Juglans ailantifolia等為材料，通過改良CTAB方法，從嫩芽、新鮮葉片和干葉片中分別提取核桃基因組DNA，并以此DNA為模板對RAPD-PCR反應體系中的一些重要參數進行摸索和優化試驗。結果表明，改良的CTAB法可有效去除細胞內多糖和多酚等雜質對模板DNA的污染， 大大提高DNA的數量和質量。優化適合于美國核桃、日本核桃和雜合核桃的RAPD-PCR反應體系為：在20 μL的PCR反應體系中, 含10 ng 模板DNA, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白（BSA）, 0.25 mmol/L dNTPs, 3.5 mmol/L Mg2+，1 μL 10×Taq DNA 聚合酶反應緩沖液, 0.5 U Taq聚合酶, 5.0 mmol/L RAPD引物。RAPD-PCR反應擴增程序為：92℃變性 3 min；93℃ 變性 1 min，35℃ 復性1 min，72℃延伸 1 min，35個循環；72℃后延伸10 min，置4℃ 保存。

美國白核桃；日本核桃；RAPD；優化

核桃屬Juglans 是胡桃科Juglandaceae 的一個進化屬[1], 該屬成員多為重要的經濟林樹種, 不僅能生產營養價值高的食用核桃果仁，而且木材材質好、生長快[2]。核桃屬植物在全球的栽培歷史久遠，種質資源極為豐富，約有21個種[3]，是一個非常重要的用材和堅果經濟樹種之一[4]。美國白核桃J.cinerea，也叫白核桃、灰核桃、油核桃或檸檬核桃，是一種短期生長、耐寒、速生的用材和經濟樹種[2-3,5], 可以生產優良木材，果實可以食用并可榨油。20世紀70年代，該樹種受到一種外來病菌Sirococcus clavigignenti-juglandacearum 的危害，已瀕臨滅絕[3]。日本核桃J.ailantifolia，又稱為心核桃，源產于日本和庫頁島[6],1870 年被引入美國[7-8]。美國黑核桃 J.nigra 通常也稱為東方黑核桃或者美國核桃，為經濟價值較高的用材樹種[9]，在我國栽培十分廣泛。我國核桃屬植物栽培歷史也十分悠久，在長期進化與栽培過程中，表現出了一些特有的優良性狀，如孤雌生殖、早實[10]、豐產和抗性強等。目前，我國主要栽培的核桃品種有以下6個種：分別是核桃J.regia、鐵核桃J.sigillata、美國黑核桃J.nigra、麻核桃J.hopeiensis、胡桃楸J.mandshurica和野核桃J.catheayensis[1,11-12]。

隨著分子生物學的發展，20世紀90年代后DNA分子標記開始廣泛應用于植物分子遺傳育種、分子進化等研究領域。DNA分子標記是DNA分子水平上遺傳多態性的直接反應，表現為核苷酸的差異[13-14]。隨機擴增多態性DNA 分子標記 (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ，簡稱RAPD，常常呈共顯性遺傳[13]。應用RAPD分子標記技術進行物種品種鑒定，方法簡單、快捷、可靠，不需要任何前期DNA模板信息[4,13,16]。國內外也曾報道有RAPD技術在核桃屬植物核桃的研究和應用[10,15-16]。但是針對美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃的RAPD-PCR反應體系報道較少。DNA的提取和RAPD-PCR反應體系的優化，是對核桃屬植物進行遺傳育種等分子生物學研究必須首先解決的關鍵問題之一。 本研究的目的：（1）以美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃為試驗材料，研究優化從葉片中提取基因組總DNA的方法和步驟。（2）進一步研究以上幾個核桃屬植物RAPD反應體系中各種組分的濃度、PCR反應的溫度和反應程序等對PAPD-PCR擴增的影響效果，找出適合以上幾個樹種的RAPD-PCR反應體系的優化方案，從而為核桃屬植物在分子水平開展的相關研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美國白核桃和雜種核桃試驗樣品來源于美國不同州和地區的馬特爾（Martell）核桃遺傳育種試驗地；日本核桃采集于美國加州國家種質資源中心；美國黑核桃樣品采集于印第安納州巴特勒維爾（見表 1）。4月份從健康植株上采集嫩芽，5月份從健康植株上采集當年生新鮮嫩葉2～3片（單株），放入標記好的塑料袋中，用保溫箱迅速運回實驗室，保存于4℃ 冰箱中，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取與分離方法

DNA的提取與分離參照Doyle and Doyle等人提出的CTAB法[17]，并在此基礎上進行了改良。稱取約100 mg新鮮葉片，去除葉脈 （或者采用干葉片），放入2 mL screw-cap試管中，并加入2粒0.5 cm 大小的硬珠豆（Bio 101-Savant, Carlsbad, CA,USA），再加入 1 mL CTAB 提取緩沖液[18]。緩沖液包括 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 50 mmol/L TrisCl, 20 mmol/L EDTA, pH值8.0, 1.4 mol/L NaCl, 0.4 mol/LLiCl, 2% PVP(polyvinylpyrrolidone), 2% SDS。 然 后 用 快 速離心機研磨，研磨之前迅速加入β-疏基乙醇（β-Mercaptoethanol，2%）。將樣品在研磨機（Fast Prep 120，Bio 101-Savant, Carlsbad, CA） 轉速為55的速度下混勻，40 s 3次，每次間隔期間將樣品放到冰上冷卻3 min。研磨之后，將樣品放到65 ℃ 的雜交爐中勻速旋轉，過夜后取出樣品，加入400 μL氯仿并輕輕混勻，室溫13 000 r/min離心5 min。取上清液置1.5 mL離心管中，加入450 μL 混合液（V苯酚∶ V氯仿∶ V異戊醇=25∶ 24∶ 1）后輕輕混勻，室溫13 000 r/min 離心10 min。取上清液置1.5 mL離心管中，加入400 μL氯仿并輕輕混勻，室溫13000 r/min離心5 min（重復2次）。再取上清液置1.5 mL離心管中，加入 90 %的冷卻異丙醇（4 ℃）和 10 % 的醋酸鈉（3 mol/L NaAc, pH 6.8）并輕輕混勻，室溫19 000 r/min 離心15 min。去上清夜，加750 μL的70 % 乙醇洗2～3次，輕輕將乙醇液體倒掉，注意保留離心試管底部的白色結晶狀物質，室溫干燥后溶于TE 緩沖液（10 mmol/L of Tris, 1.0 mmol/L of EDTA, pH值 8.0）中, 在37℃水浴鍋中放置40 min, 然后置于4℃冰箱保存。

表 1 核桃樣品與種質資源信息Table 1 Sample information and the sources of germplasm for this study

1.2.2 DNA檢測方法

分別采用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。TE緩沖液作為空白對照，用 NanoDrop-8000分 光 光 度 計 （Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 19810, USA） 檢測DNA質量和濃度。用含有5 mg/mL溴化乙錠的1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。DNA在稀釋至所需要的濃度后，保存于-20℃冰箱，初始濃度的基因組DNA置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 PCR 擴增和PCR產物的檢測

PCR擴增引物為40個RAPD序列引物由Gene link 公司合成 （見表2）。PCR擴增反應以Williams等[12]和Woeste等[14]的反應體系為基礎。Taq DNA 聚合酶反應緩沖液 [100 mmol/L Tris-HCl, pH 值8.8, 15 mmol/L MgCl2, 500 mmol/L KCl and 0.01% （w/v）gelatin] 購于 Stratagene 公司（La Jolla, California, USA）, Taq DNA聚合酶、dNTPs和牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin , BSA） 購于Promega 公 司（Madison ,Wisconsin, USA）。PCR 反應體系 20 μL，其中 dNTPs 0.2 mmol/L，BSA 0.5 mg/mL，TaqDNA聚合酶0.3 U，引物濃度為 0.8 μmol/L, Mg2+濃度為 1.5 mmol/L, DNA 模板質量濃度為5 ng/L。當一種反應成分進行濃度（用量）梯度變化實驗時，其它反應成分濃度或者用量不變，通過比較不同處理對RAPD-PCR擴增結果的影響進行分析。PCR反應成分的處理因素和水平設計見表 3。 PCR 擴增程序為：94℃變性5 min；93℃變性 30 s，35℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃后延伸 10 min，置 4℃ 保存。

每個 PCR 產物 （10 μL） 與 0.5 μL 上樣液 染 料 （40 % w/v sucrose, 15 % ddH2O和 30 %glycerol）混合上樣，采用1×TAE緩沖液制成2.0%的凝膠瓊脂糖電泳膠，加熒光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium Bromide, EB）染色到電泳膠中，然后設置90 W 恒功率電泳，約1.5 h，溴酚藍指示劑跑至接近膠底部時，終止電泳。用凝膠成像儀（75312 Bad Wildbad, Germany）檢測PCR產物擴增，DNA 片段大小標準用100 bp ladder(Madison,Wisconsin, USA）。

2 結果與分析

2.1 提取核桃基因組DNA的改良CTAB方法

實驗（見圖1）表明，采用改良后的CTAB方法均適合于從老葉、新葉、干葉和嫩芽中獲得高濃度和純度的DNA，有效地降低多糖和酚類物對DNA的污染。改良后的CTAB法，從核桃新鮮葉片中所得到的DNA樣品濃度高，平均為763.4 ng/μL，是大部分實驗結果DNA提取濃度50 ng/μL的15倍左右；從干葉片中提取出來的DNA濃度平均為196.84 ng/μL，從嫩芽得到的DNA平均濃度為 2 980.4 ng/μL，分別是普通鮮葉片和干葉片的3.9倍和15.1倍。分別從新鮮葉片、干葉片和嫩芽中獲得的高質量DNA均可以進一步用于分子生物和分子遺傳學等方面的實驗操作。DNA測定的A260/A280值平均為2.10，A260/A230值平均為2.04，符合基因組DNA的最佳范圍值，說明改良后的CTAB法可應用于從核桃屬植物新鮮葉片和干葉片中提取高質量和純度的DNA。試驗中，采用改良CTAB法，得到的DNA沉淀呈乳白色結晶狀，加TE緩沖液易溶解，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測時，點樣孔無帶，且主帶非常明顯 （見圖 1）。

表 2 40個隨機多態性DNA引物序列Table 2 Sequence of forty RAPD primers used in this study

表 3 RAPD-PCR 反應體系的處理因素和水平設置Table 3 The design factor and level of RAPD-PCR reaction system

圖1 改良CTAB法提取總DNA的電泳檢測結果Fig.1 Agarose gel results of genomic DNA products using improved CTAB method

2.2 RAPD-PCR反應體系

2.2.1 Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度的影響

當Mg2+濃度為1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為4個設置的用量時，均產生少量DNA條帶，PCR擴增效果不佳。從擴增結果可知，當Mg2+濃度梯度為3.5 mmol/L時，TaqDNA聚合酶濃度為0.5 U 組合時擴增DNA特異條帶最為清晰，擴增多態性強且效果最好（見圖 2）。

圖2 不同Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度條件下RAPD-PCR擴增產物結果Fig.2 Results of RAPD-PCR products using different Mg2+ concentration and different amount of Taq DNA polymerases

2.2.2 模板DNA和引物濃度的影響

引物濃度對RAPD-PCR擴增影響較大，引物濃度在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L時沒有任何PCR產物。模板DNA濃度對PCR擴增效果影響不大，對幾個不同種的核桃和雜種核桃樣品擴增試驗結果為，DNA模板濃度為 10 ng/μL和引物濃度為5.0 mmol/L組合時得到的RPAD-PCR擴增產物效果最好。

2.2.3 BSA和dNTPs濃度的影響

結果表明，BSA濃度梯度對RAPD-PCR擴增影響并不顯著。當BSA 濃度為0.10 mg/mL時，DNA特異條帶最為清晰。在此基礎上，dNTPs濃度為0.25 mmol/L時得到的PCR產物效果非常好。

2.2.4 反應擴增程序的影響

研究發現，2個RAPD引物組合進行PCR擴增時退火溫度為35℃效果最好。對變性溫度和時間篩選結果表明，在 93℃下1 min效果最為理想；退火時間和延伸時間也均為60 s時，擴增結果最好。熱循環次數分別設置了30、32、35和38。結果表明，在35個循環下，擴增的條帶多態性最好，如果降低循環次數，擴增條帶多態性會降低。

經過對RAPD-PCR優化后，采用美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃的DNA樣品分別進行了試驗，均可以到很好的PCR擴增效果（見圖 3）。

3 討 論

3.1 基因組總DNA提取方法

DNA的提取是分子生物學研究的基礎技術，近些年來一些新的或者改良的DNA提取純化方法不斷出現[19-20]。不同植物DNA提取方法往往有差異，特別是富含多糖及多酚類物質的果樹葉片中提取DNA方法難度大于禾谷類及蔬菜類植物[21-22]。從核桃屬植物葉片中用CATB法提取基因組總DNA主要有以下幾個方面的改良和優點：一是，加入2粒硬珠豆在試管中，在快速離心機的研磨后，放到雜交爐中，設置65 ℃勻速搖晃過夜，使得細胞充分破裂，有利于提純。二是，加入更多的SDS（2 %）能使裂解細胞變易,使染色體離析，蛋白變性，同時SDS與蛋白質和多糖結合成復合物,釋放出核酸。這樣就可以很好地裂解細胞，去除較多的糖類雜質。三是，適當加大β-巰基乙醇劑用量，能防止多酚污染。同時，用苯酚、氯仿、異戊醇的混合液（v/v，25∶24∶1）提純步驟，可以提高DNA質量，因為異戊醇可以減少提取震蕩過程中的氣泡產生。四是，提取的每個步驟過程中，可加入50～100 μL的TE緩沖液，可以大大增加上清液的量，并且可以得到更多的DNA，獲得的DNA純度高、數量多，并能夠滿足各種分子生物學試驗要求。CTAB法經過改良之后，操作簡單，不需要太多的儀器。缺點是操作步驟相對繁瑣。利用核桃的鮮葉片和干葉片對改良后的CTAB法進行了檢測，提取DNA純度和質量都很高。在CTAB中加入2 %的PVP可以有效去除多糖，并可與多酚結合形成復合物，從而有效避免多酚類化合物介導的DNA降解[19,23-24]。

3.2 RAPD-PCR反應體系的優化

在不同植物中， RAPD-PCR反應體系的優化試驗報道很多，研究者大都認為RAPD技術很大程度上有著不穩定性，重現率低的缺點。Mathews等[25]證明RAPD可在草莓上多次重復相同的實驗結果；吳燕民等[11]也通過相同的RAPD產物重復的結果證明鐵核桃為核桃屬中一個獨立種。經過本試驗結果表明，用相同的試劑和藥品，在相同的反應體系和實驗條件下，RAPD-PCR分析還是具有很高的重復性，這與王正加等[25]報道胡桃科山核桃的研究結果一致。

TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，Mg2+濃度過高會抑制Taq酶的活性，過低對Taq酶的活化不夠，影響擴增效果。本試驗對美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃及雜種核桃RAPD-PCR反應中Taq酶的用量為0.5 U，Mg2+最佳濃度為3.5 mmol/L。Mg2+濃度與其他研究結果Mg2+濃度為2.5～3.5 mmol/L接近[4,9-10]，同時，大部分研究結果Taq酶的用量為0.4～1.0 U，而張美勇等[4]RAPD研究中Taq酶的用量為0.03 U，這可能與Taq酶的成分有關。經試驗表明，引物濃度的高低會對RAPD擴增效果影響很大。引物濃度過高，會使非特異性譜帶增加；反之，則導致擴增譜帶明顯減少。在核桃PCR反應體系的研究中，RAPD引物濃度的差異較大[4,16]，本試驗中對日本核桃、美國核桃和雜種核桃的RAPD引物濃度為5.0 mmol/L，PCR擴增效果佳，與Nicese等[26]的研究結果4.0 mmol/L接近。 DNA模板濃度和純度對RAPD-PCR反應結果也有一定影響，DNA模板濃度一般大于10 ng, 而楊克強等[16]RAPD-PCR反應中用150 ng模板DNA也能獲得較好的擴增結果。BSA 可以封閉乙酰對RAPD擴增反應的抑制作用[28]，用于PCR可改善擴增結果的特異性與酶的穩定性，增加PCR產量及產物[29-30]。大部分研究的試驗材料在RAPD-PCR反應體系中都沒有加入BSA增效劑，但在本實驗中，加入BSA后，RAPD-PCR擴增效果明顯比不加要好，產物條帶清晰，且量多。

3.3 RAPD-PCR反應條件的優化

預變性是指DNA在溫度升到一定程度時雙鏈打開，形成單鏈的過程。合適的預變性時間是PCR擴增成功的必要條件。本研究中，對幾個核桃物種的預變性溫度和時間分別是92 ℃，3 min。在其他核桃屬植物研究中，山核桃為94 ℃，2～5 min[26]；核桃為 95℃，5 min[4]、94℃，5 min[10]。大量研究結果表明，復性時間為1 min，張美勇等[4]80 s，Woeste等[31]30 s；延伸時間多為2 min，本試驗中1 min延伸時間為最佳。退火溫度是引物與模板DNA結合的關鍵。溫度太高，背景雖然清晰，但條帶數量明顯減少；溫度太低，非特異性譜帶明顯增加，甚至背景發亮。退火溫度根據不同的RAPD引物可以適當調整，一般為35 ℃或者36 ℃為最佳。山核桃的最佳退火溫度為38 ℃，30 s[26]。RPAP-PCR反應的程序多為40個循環以上，山核桃為38個循環[26]，核桃為43、45、45個循環[4,11,32]。本試驗結果表明，RAPD-PCR反應程序為35個循環下可以得到理想的擴增效果，這樣可以節約時間。

致謝 ：感謝Marcia Kremer，Charles Michler，Lisa Worthen，Janis Gosewehr，Hannah Bergeman，黃忠蓮 (Julie) 對本實驗研究的技術支持，James McKenna對試驗材料的采集。

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Optimization of RAPD-PCR reaction system for American and Japanese walnut

ZHAO Peng1,2,3, WOESTE E.Keith2, ZHANG Cun-xu1, CHENG Fei1, ZHANG Shuo-xin1,4, CAI Jing1
(1.College of Forestry, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 2.USDA Forest Service Hardwood Tree Improvement and Regeneration Center, Dept.of Forestry and Natural Resources, Purdue University, West Lafayette,IN 47907, USA; 3.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, Shannxi, China; 4.Qinling National Forest Ecosystem Research Station, Ningshan 711600, Shaanxi, China)

Germplasm resources for the genus Juglans (Juglandaceae) are rich, and the genus contains many tree species, commonly called walnuts, that are valued for their high quality timber and nuts.The CTAB method was improved to extract genomic DNA from walnut buds, fresh and dried leaves.Using the obtained DNA as templates, the important parameters influencing the application of RAPD-PCR for walnut species were optimized.The results indicate that the modified CTAB method more effectively removed most of the polysaccharides in the cytoplasm and inhibited the formation of oxidized polyphenolic compounds, compared with the traditional CTAB method.The optimal RAPD-PCR reaction conditions for Juglans cinerea , Juglans ailantifolia , J.nigra, and species hybrids included, in a total volume 20 μL, 1μL of 10 ng/μL DNA, 2 μL of 10×Taq DNA polymerase reaction buffer (1.5 mmol/L Mg2+),2.5 μL of 200 mmol/L dNTPs (0.25 mmol/L), 2 μL of 1mg/mL BSA (bovine serum albumin, 0.1 mg/mL), 2 μL of 25 mmol MgCl2(2.5 mmol), 4 μL of 50 mmol RAPD decamer primer pair, 0.5 units Taq polymerase, and 5.0 μL sterilized distilled water.Thermal cycling conditions were as follows： denaturation 3 min at 92℃ ; 35 cycles of 1 min at 92℃ , 1 min at 35℃ , 2 min at 72℃ ; and a final extension of 10 min at 72℃ at the end of the amplification.

butternut；heartnut；RAPD；optimization

2011-10-21

國家“十二五”科技支撐計劃課題“高效可持續農林復合系統構建及調控技術研究”（2011BAD38B0202）；西北大學科研啟動基金（PR11055）；美國印第安納州自然保護局核桃遺傳與保護研究項目（#2041-0006）

趙 鵬（1980- ），男，陜西榆林人，講師，博士，主要從事植物分子進化和分子生態學研究

蔡 靖（1968- ），女，陜西子洲人，副教授，博士，研究方向：植物生理生態和森林生態；E-mail：cjcaijing@163.com

S792.13

A

1673-923X(2012)03-0129-07

[本文編校：謝榮秀]