柚木愈傷組織誘導培養(yǎng)的研究

郭彥彤，梁坤南，黃桂華，曾炳山，裘珍飛，周再知

柚木愈傷組織誘導培養(yǎng)的研究

郭彥彤，梁坤南，黃桂華，曾炳山，裘珍飛，周再知

(中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

以MS、1/2 MS和WPM為基本培養(yǎng)基分別添加0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA，以柚木無菌組培瓶苗的莖尖，帶節(jié)間的莖段，不帶節(jié)間莖段、葉片為外植體，分析不同類型培養(yǎng)基、外植體對柚木愈傷組織生長的影響；并以MS為基本培養(yǎng)基、莖段（不帶節(jié)間）為外植體進行生長調(diào)節(jié)劑水平、固液培養(yǎng)方式、光照條件及培養(yǎng)時間試驗，探討柚木愈傷組織生長的最佳培養(yǎng)條件。結果表明：MS培養(yǎng)基適合愈傷組織生長，外植體莖段（不帶節(jié)間）為較適外植體，較適生長調(diào)節(jié)劑濃度組合為0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA及2 mg·L-1NAA +2 mg·L-16-BA，暗培養(yǎng)28 d后轉到光下培養(yǎng)的愈傷誘導率最高，濾紙橋液體培養(yǎng)方式有利于愈傷的誘導，愈傷組織最適繼代時間為30～35 d。

柚木；莖段；組織培養(yǎng)；愈傷組織誘導

柚木Tectona grandis為熱帶高大闊葉喬木，結構致密、材質(zhì)堅韌、不翹不裂，紋理通直美觀，色澤溫和，耐腐，抗蟲等特點，廣泛應用于家具、雕刻等生產(chǎn)用材，為世界名貴的用材樹種[1-5]。

目前，國內(nèi)外的柚木的組培快繁技術已經(jīng)非常成熟，而且我國的柚木快繁技術現(xiàn)已完全達到了工廠化育苗的要求，但我國引種的柚木在栽培上還面臨著樹木最初開花期過早(影響主干高度生長)[6]，土壤酸性、低溫凍害、病蟲害等問題的困擾[7]，利用植物基因工程對延遲其最初開花時間、改良柚木材性、增強抗逆性等優(yōu)良性狀是一個行之有效的途徑，而愈傷組織誘導是實現(xiàn)這一途徑的基礎。

有關柚木愈傷組織誘導及再生的研究報道較少，而且基本為國外的研究報道，我國在此方面的研究較遲，尤其是針對性地進行柚木愈傷組織誘導的相關研究尚未有報道。作者借鑒前人的研究成果[8-12]，通過對基本培養(yǎng)基的篩選和對培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗，旨在篩選出柚木愈傷組織生長較好的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，為柚木的再生體系建立、遺傳轉化等生物技術的研究奠定初步的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國林科院熱帶林業(yè)研究所選育的柚木優(yōu)良無性系7114無菌苗，該無性系選自海南尖峰嶺柚木種源試驗的優(yōu)良單株，是經(jīng)初代及繼代培養(yǎng)后的組培瓶苗。

1.2 試驗設計與方法

培養(yǎng)基及外植體篩選試驗采用MS，1/2MS，WPM培養(yǎng)基，以葉片、帶節(jié)間的莖段、不帶節(jié)間的莖段、莖尖(即無菌苗頂芽)為外植體。不同光照條件(暗培養(yǎng)7、14、21、28 d，并以一直暗培養(yǎng)為對照，共5個處理)、培養(yǎng)方式(濾紙橋液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng))以及培養(yǎng)時間(5、10、15、20、25、30、35 d)對莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織生長影響的試驗采用MS培養(yǎng)基。以上試驗均加入1.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA。在MS基本培養(yǎng)基上進行生長調(diào)節(jié)劑 NAA(0.5、1、2 mg·L-1)和 6-BA(0、0.5、1、1.5、2、3、4 mg·L-1)組合的雙因素完全隨機試驗設計，研究NAA與6-BA兩種激素對莖段（不帶節(jié)間）愈傷組織生長的影響試驗。培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g·L-1，用瓊脂7 g·L-1固化，pH在高壓滅菌前調(diào)至5.8。上述實驗每個處理接種外植體30個，重復3次。

1.3 培養(yǎng)條件及統(tǒng)計分析

培養(yǎng)室溫度(25±2) ℃，每日光照時數(shù)10 h，光照強度1 800～2 000 lx(暗培養(yǎng)除外)，觀察4～6周后，統(tǒng)計愈傷組織發(fā)生情況。所有百分率數(shù)據(jù)在進行方差分析前經(jīng)反正弦變換，采用SPSS14.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和最小顯著差異性檢驗(LSD法，P < 0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基及不同外植體對愈傷組織生長的影響

方差分析結果(見表1)表明，外植體間柚木愈傷誘導率差異極顯著(P＜0.01)，其中不帶節(jié)間的莖段、葉片最好，誘導率均達到70%以上，它們與帶節(jié)間莖段和莖尖的誘導率相比差異顯著和極顯著。3種基本培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基與外植體的交互作用對愈傷組織誘導影響達到顯著水平，多重比較表明MS基本培養(yǎng)基要好于1/2MS、WPM基本培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基和與外植體對誘導率影響的方差分析?Table 1 Variance analysis of effects of basic mediums and explants on callus induction

外植體接入培養(yǎng)基后10 d左右首先在切口處開始萌動，產(chǎn)生愈傷的質(zhì)地、狀態(tài)以MS培養(yǎng)基最好。MS培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷基本呈黃色到乳黃色、為致密的，顆粒狀的愈傷組織。1/2 MS培養(yǎng)基誘導的愈傷為乳黃色，呈水漬狀，不適宜進一步的繼代培養(yǎng)。WPM培養(yǎng)基上誘導的愈傷莖段(不帶節(jié)間)為乳白色到灰白色，質(zhì)地疏松，易碎，無光澤，帶節(jié)間莖段及葉片的愈傷長的較慢呈黃色致密狀。莖尖在此處理條件下只有在MS培養(yǎng)基中才會誘導產(chǎn)生愈傷(見圖1)，說明了MS培養(yǎng)基適宜不同外植體的愈傷組織誘導。觀察還發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中一般帶節(jié)間的莖段產(chǎn)生的愈傷基本是在腋芽萌發(fā)后產(chǎn)生較大的愈傷(平均直徑9 mm)，若腋芽未萌發(fā)則或者不產(chǎn)生愈傷或者愈傷很小(平均直徑2 mm)。WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的帶節(jié)間的莖段的腋芽長的很小，這也是在進行柚木快繁時采用MS為基本培養(yǎng)基的原因。

圖1 不同培養(yǎng)基及不同外植體對愈傷誘導的影響Fig.1 Effects of different basic medium and different explants on callus induction

由圖1可知MS培養(yǎng)基中外植體不帶節(jié)間的莖段的誘導率最高，達到74.47%，其次是葉片、帶節(jié)間的莖段和莖尖，誘導率分別為74.24%、45.45%和33.33%。葉片誘導的愈傷在后期的繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其較易褐化，莖段(不帶節(jié)間)愈傷的生活力相對較旺盛，適合用來進行繼代培養(yǎng)。權衡愈傷組織的誘導率及其生長情況，使用MS培養(yǎng)基較合適，外植體采用不帶節(jié)間的莖段較好。

2.2 不同光照條件對莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導的影響

分別暗培養(yǎng)7、14、21、28 d后，再進行光培養(yǎng)，以暗培養(yǎng)為對照，共5種不同的光照處理模式，30 d后愈傷組織的出愈率結果表明，暗培養(yǎng)28 d后轉為光培養(yǎng)的處理愈傷組織的誘導率顯著高于其它4種處理(P < 0.05)(見表2)，說明暗培養(yǎng)對柚木莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導有很大的影響。適宜的暗處理有利于莖段(不帶節(jié)間)愈傷的生長，同時實驗也發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)1～2周后將外植體放于光下培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷雖然顏色、質(zhì)地差異不大，但產(chǎn)生的愈傷大小要遠遠小于暗培養(yǎng)3～4周后的愈傷，且生長狀況也不如后者。始終暗培養(yǎng)的愈傷組織誘導率低于暗培養(yǎng)28 d后再光照的處理，說明適當?shù)墓馀囵B(yǎng)對柚木莖段(不帶節(jié)間)愈傷的誘導也有一定的促進作用，光暗交替培養(yǎng)可以有效提高愈傷的誘導率。

表2 不同光照條件對愈傷組織誘導的影響?Table 2 Effects of different light conditions on callus induction

2.3 不同培養(yǎng)方式對莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導的影響

在MS培養(yǎng)基上分別設置濾紙橋液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種方式誘導莖段(不帶節(jié)間)愈傷。由表3可看出采用濾紙橋液體誘導的方式愈傷誘導率要好于固體培養(yǎng)基，愈傷為綠色，有光澤，致密；固體培養(yǎng)基產(chǎn)生淺黃色或黃綠色、致密的愈傷組織，但前者愈傷需要15 d左右時間才有愈傷產(chǎn)生，固體培養(yǎng)基7 d左右便可見，總體認為濾紙橋液體培養(yǎng)方式好于固體培養(yǎng)方式，有利于愈傷的誘導。

表3 不同培養(yǎng)方式對愈傷組織誘導的影響?Table 3 Effects of culture modes on callus induction

2.4 不同激素水平對莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導的影響

試驗選擇NAA和6-BA的組合為激素配比，以MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g·L-1蔗糖、7g·L-1瓊脂，接入7 mm長的無菌幼苗莖段(不帶節(jié)間)。35 d后統(tǒng)計外植體誘導出的愈傷組織的平均直徑及其誘導率。

從表4中可以發(fā)現(xiàn)單獨添加生長素NAA（濃度0.5～2 mg·L-1）不能誘導莖段(不帶節(jié)間)產(chǎn)生愈傷組織，外植體只是腫脹，有些會長出白色透明的須根。當6-BA與NAA共同作用后會誘導愈傷組織產(chǎn)生。試驗中還發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生兩種類型愈傷，一種為致密型的；一種為疏松易碎型。當6-BA質(zhì)量濃度低于2 mg·L-1時誘導產(chǎn)生顏色為淺黃到黃色的致密的愈傷，高于或等于2 mg·L-1時產(chǎn)生黃色到黃綠色的疏松易碎的愈傷組織，并且前種愈傷誘導率較低，在本試驗的濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生致密的愈傷以1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA組合誘導率最高，平均直徑大小隨著NAA濃度的增大呈逐漸減小的趨勢。

對于第二種疏松型的愈傷組織誘導率基本都能夠達到50%以上，這種愈傷適用于進行液體懸浮繼代培養(yǎng)，6-BA與NAA濃度比在1～1.5 mg·L-1有利于愈傷組織的生長，此類愈傷以2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1NAA為最好的激素組合。方差分析結果顯示（見表5），兩種激素以及其交互作用對柚木幼苗莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導率及愈傷直徑大小均達到了顯著差異(p< 0.05)。綜合考慮認為NAA濃度選擇0.5 mg·L-1，1 mg·L-1較好，6-BA濃度選擇1～3 mg·L-1較適宜，濃度過高過低均不利于愈傷的誘導及生長。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑水平對愈傷組織誘導的影響Table 4 Effects of different growth regulator levels on callus induction

表5 NAA和6-BA對愈傷大小和誘導率影響的方差分析?Table 5 Variance analysis of effects of NAA and 6-BA on callus growth and callus induction

2.5 培養(yǎng)時間對莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織生長的影響

對不同培養(yǎng)天數(shù)的柚木愈傷組織鮮重建立了柚木愈傷組織生長曲線，從圖2可以看出柚木愈傷組織的生長曲線大致呈S形。愈傷生長萌動期較長，接種后的前20 d生長曲線較為平滑，這段期間可以看到切口處產(chǎn)生很少淺黃色透明的愈傷組織，20 d后進入對數(shù)生長期，在20～30 d期間，愈傷組織生長速度明顯加快，可以看到愈傷組織長滿整個外植體，且28 d后將培養(yǎng)基轉移到光下培養(yǎng)，愈傷組織生長快速加快與此期間的光照培養(yǎng)應該也有很大關系。30～35 d愈傷生長變緩，處于生長平穩(wěn)期。所以可以認為柚木愈傷組織最適繼代時間為30～35 d，這一研究與陳榮[13]、李琰[14]等人對愈傷組織生長的研究相似。

3 結論與討論

圖2 不同培養(yǎng)時間對柚木愈傷組織生長的影響Fig.2 Effect of culture time on callus growth

植物愈傷組織的誘導主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境三大因素的調(diào)控[15]。一般認為，高鹽的基本培養(yǎng)基較適合愈傷組織的生長，在本試驗中高鹽的MS培養(yǎng)基適合柚木愈傷組織生長，中鹽的1/2MS和WPM雖也可以誘導產(chǎn)生愈傷，但愈傷或水漬化或無光澤，生活力不強，不適宜莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織的誘導。Baghel等[10]在對不同基本培養(yǎng)基的選擇試驗中也采用MS培養(yǎng)基用于愈傷誘導以及再生全過程，他們在試驗中發(fā)現(xiàn)外植體在MS培養(yǎng)基中愈傷生長的綜合反應好于其它培養(yǎng)基。Kushalkar等[9]也采用MS培養(yǎng)基應用于柚木體細胞胚胎發(fā)生的研究。當然也有學者認為1/2MS[9]，WPM[11-12]培養(yǎng)基為柚木愈傷誘導較適的培養(yǎng)基，這有可能是因為外植體不同，或者使用的激素種類不同導致對不同基本培養(yǎng)基的反應不同，所產(chǎn)生的愈傷質(zhì)地不同。本試驗中以6-BA和NAA兩種激素共同處理的情況下，MS培養(yǎng)基誘導的愈傷質(zhì)地，顏色均好于另外兩種基本培養(yǎng)基，因此，認為MS培養(yǎng)基為最適的基本培養(yǎng)基。

由于植物組織或細胞在離體培養(yǎng)條件下往往缺乏合成生長素和細胞分裂素的能力，為了使細胞生長、分化和分裂，在多數(shù)情況下需要生長素和細胞分裂素兩種生長調(diào)節(jié)劑的作用[16]，而且很多研究表明生長素和細胞分裂素配合使用時效果更好。Rosilah[6]在對柚木愈傷組織誘導的試驗中研究也證明6-BA與NAA這兩種激素共同作用有利于愈傷的誘導。Baghel等[9]采用子葉、上胚軸等部位做為外植體時發(fā)現(xiàn)單獨添加生長素NAA、2,4-D都可以誘導愈傷的產(chǎn)生。筆者在前期預試驗過程中曾采用葉片為外植體，單獨添加生長素NAA(0.5 mg·L-1)進行誘導，也可以產(chǎn)生愈傷，而本試驗采用莖段（不帶節(jié)間）為外植體，在只含有NAA(0.5～2 mg·L-1)的培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導率為零，當和一定濃度的6-BA配合使用時，愈傷組織的誘導率大大提高，產(chǎn)生的愈傷組織較多且質(zhì)量好，而且有利于愈傷組織的增殖，這種現(xiàn)象說明柚木的不同外植體內(nèi)部的激素含量水平不同，促使激素對外植體的愈傷誘導效果存在差異，即由于外植體或基因型不同，導致各自的生理狀態(tài)和所處的生育時期不同，其內(nèi)源激素濃度和比例不同，以至于出現(xiàn)不同植物的器官和組織，其形態(tài)發(fā)生能力大不相同，或者即使同種植物不同部分做外植體時，所需要的營養(yǎng)和植物激素的用量也不相同[17]。

本試驗中產(chǎn)生兩種類型的愈傷組織(圖3)，方差分析表明與6-BA的濃度有關，當6-BA處于低濃度狀態(tài)下（小于2 mg·L-1）產(chǎn)生致密的愈傷組織，高濃度下（大于或等于2 mg·L-1）產(chǎn)生疏松的愈傷。細胞分裂素的主要生理作用是促進細胞的分裂和擴大，誘導芽的分化，促進側芽的萌發(fā)生長，抑制衰老；而生長素主要是促進細胞伸長生長和細胞分裂，誘導受傷的組織表面一至數(shù)層細胞恢復分裂能力，形成愈傷組織，誘導生根[18]。本試驗中單獨添加生長素NAA（濃度為1～2 mg·L-1時)，莖段（不帶節(jié)間）外植體有須根產(chǎn)生就是由于生長素有促進生根這一作用的原因。Baghel等[10]采用不同的激素處理產(chǎn)生了不同狀態(tài)、質(zhì)地、顏色的愈傷，有致密的，疏松的易碎的；表面干燥的，水漬狀的；顏色有白色的、深綠或淺綠、黃色的。許耀祖等[19]在研究薰衣草愈傷誘導情況也發(fā)現(xiàn)采用同樣兩種激素處理會產(chǎn)生兩種不同類型的愈傷組織，這些都證明了不同外植體、不同的激素類型以及激素比例產(chǎn)生的愈傷類型也會存在很大差異。本試驗中兩種愈傷組織都不易褐化，有生活力，適于進行再生分化誘導的愈傷組織因植物種類、外植體等因素不同既有較致密型的又有疏松易碎型的，其中前者適合用于固體培養(yǎng)，后者為進行液體懸浮培養(yǎng)較適愈傷組織。Widiyanto等[12]將產(chǎn)生的淺黃色致密的愈傷組織進行分化培養(yǎng)，最終誘導產(chǎn)生了再生植株。Rosilah等[9]將產(chǎn)生的白色易碎的愈傷進行液體懸浮培養(yǎng)，愈傷產(chǎn)生了胚狀體的初期結構(近心型胚)。根據(jù)愈傷質(zhì)地、誘導率及平均直徑大小三項指標認為本試驗中激素濃度組合MS＋0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA及MS＋2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA為于愈傷組織的誘導及生長最適培養(yǎng)基。

圖3 濾紙橋液體培養(yǎng)基(左)；固體培養(yǎng)基及致密型愈傷(中)；疏松易碎型愈傷(右)Fig.3 Filter paper bridge with MS liquid medium(left); MS solid culture medium and compact callus(middle);Discrete and friable callus(light)

在愈傷組織誘導階段，一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三種形式。愈傷組織的誘導一般需弱光或不需光，而愈傷組織生長往往需要光照。根據(jù)愈傷組織生長曲線也可知培養(yǎng)到第3周后愈傷開始大量生長，而不同暗培養(yǎng)處理中，暗培養(yǎng)兩周后將外植體轉移到光下培養(yǎng)愈傷誘導率不高，而且長勢也不如之后的處理，說明愈傷誘導前期需要3周左右的暗培養(yǎng)時間，然后愈傷進入分裂期，開始迅速生長，這時候進行光培養(yǎng)可以促進愈傷的生長。如果僅進行光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)誘導率均為75%左右，但本試驗先暗培養(yǎng)28 d然后進行光培養(yǎng)誘導率可達到90%以上，說明光暗交替培養(yǎng)有利于愈傷的誘導及生長。

濾紙橋液體培養(yǎng)較常用于植物組培快繁及生根誘導試驗[20-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基的誘導率及其愈傷顏色質(zhì)地要好于固體培養(yǎng)基，誘導率可達到100%，而在固體培養(yǎng)基為75%，有些外植體由綠色變?yōu)辄S色，最終死亡，可以推測外植體愈傷萌動誘導期間應需要大量的營養(yǎng)元素，液體培養(yǎng)基恰好可以滿足外植體短期內(nèi)選擇吸收所需的營養(yǎng)成分的需要，而外植體在固體培養(yǎng)基中對營養(yǎng)元素的吸收效果應沒有液體培養(yǎng)基好，此外兩種培養(yǎng)方式產(chǎn)生愈傷的顏色不同應該跟此因素也有關系(圖3)，因此認為濾紙橋液體培養(yǎng)方式更加適合愈傷的誘導。

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Research on induction and culture of callus of teak (Tectona grandis)

GUO Yan-tong, LIANG Kun-nan, HUANG Gui-hua, ZENG Bing-shan, QIU Zhen-fei, ZHOU Zai-zhi
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong，China)

Adopting the Ms, 1/2 Ms, and WPM as different basic mediums supplemented with 0.5mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA respectively, the various explants of node stem, top buds, stem (without internode) and leaves of tissue-culture container seedlings of teak (Tectona grandis L.f.), were used to study the effects of different mediums on callus growth of teak.Growth regulators, solid and liquid cultivation mode, light conditions and culture time were studied using MS as basic medium and stem (without internode) as explants to explore the best culture conditions of the callus growth.The results show that MS medium was best for callus growth.The growth regulator combinations of 0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA and 2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA were suitable for callus growth of teak.The explants cultured 28 days in dark condition then turned to light condition had higher rate of the callus induction.Filter paper bridge with MS liquid medium was better than solid culture medium.The optimal duration for callus subculture was around 30～35 days.

teak; stem; tissue culture; callus induction

S796；S722.3+7

A

1673-923X(2012)03-0053-06

2012-01-15

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項重大項目(201104001)

郭彥彤(1985—)，女，遼寧營口人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究

梁坤南(1962—)，男， 研究員，碩士生導師，主要從事林木遺傳育種研究； E-mail： lkn@ritf.ac.cn

[本文編校：歐陽欽]