云南蘿芙木異胡豆苷合成酶基因的克隆與分析

許若嫻，曹福祥，彭繼慶，司書斌

（中南林業科技大學，湖南 長沙 410004）

云南蘿芙木異胡豆苷合成酶基因的克隆與分析

許若嫻，曹福祥，彭繼慶，司書斌

（中南林業科技大學，湖南 長沙 410004）

以云南蘿芙木葉片為材料，通過RT-PCR方法首次克隆了云南蘿芙木萜類吲哚生物堿（terpenoid indole alkaloids，TIAs）次生代謝的合成途徑中重要的限速酶——異胡豆苷合成酶（strictosidine synthase，STR）的基因并進行了生物信息學分析。生物信息學分析表明，該基因的編碼區長度為1 038 bp，編碼345個氨基酸的多肽，等電點為5.06，N-端有一長度為27個氨基酸參與分泌的信號肽。二級結構預測指出，延伸鏈和不規則盤繞是STR蛋白質最大量的結構元件，而α-螺旋和β-轉角則散布于整個蛋白質。同源性分析則表明，云南蘿芙木中的STR和其它植物來源的STR同源，使用MEGA5.1構建了植物的STR分子系統進化樹。

云南蘿芙木；萜類引哚生物堿；異胡豆苷合成酶；RT-PCR；生物信息學分析

云南蘿芙木Rauvolfia yunnanensis Tsiang系夾竹桃科Apocynaceae蘿芙木Rauvolfia屬植物，主要分布于云南、廣西和貴州等地[1]。云南蘿芙木是一種重要的藥用植物，含有利血平(reserpine)、阿嗎堿(ajmalicine)、育亨賓(yohimbine)等多種萜類吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids,TIAs）[2]，是治療高血壓、性功能障礙、癌癥等疾病的原料藥。TIAs生物合成的共同前體物質是3α(S)-異胡豆苷，它是由色氨酸的衍生物色胺(tryptamine)以及萜類衍生物裂環馬錢子苷（secologanin）在異胡豆苷合成酶(STR)催化下縮合生成[3]。在多種產TIAs的植物中，異胡豆苷是TIAs的普遍前體物質，其它種屬特異性的酶和自發的轉化反應決定了之后生成的各種TIAs的最終形式。因此STR 是TIAs生物合成途徑中的最重要的關鍵酶，在TIAs代謝中具有至關重要的作用[4]。目前，STR基因已經從長春花、馬錢子、蛇根木草等植物中克隆，但還未見從云南蘿芙木中克隆該基因的報道，云南蘿芙木的研究主要集中在細胞工程和種植規范中[5]，本研究以蘿芙木葉片為材料，采用RT-PCR 克隆蘿芙木STR基因，并進行生物信息學分析，為實現蘿芙木TIAs代謝工程提供候選基因和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 云南蘿芙木中獲取STR

根據已經報道的S T R的核苷酸序列以及Bam H Ι和S ac Ι酶切位點設計引物：上游引物 fSTR5’-TATcggatccGGCCAAACTTTCTGATT CGC-3’，其中gga tcc 是Bam H Ι位點。下游引物 rS T R P5’-CAAgagctcAACCAATCTGGTTCG TGGAA-3′，其中 gag ctc 是 S ac Ι 位點。

以云南蘿芙木葉片為材料，用RNA提取試劑盒（康為世紀）提取總RNA，RT-PCR（Fermentas RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增[6]，PCR反應體系為：50 ng cDNA模板，50 mmol/L KCL,10 mmol/L Tris-HCL(pH8.3),1.5 mmol/L MgCl2,200 mmol/L dNTPs,1.25 U Taq DNA聚合酶和25×106 mmol的引物，加無菌雙蒸水至總體積為25 μL。PCR的反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃反應2 min，共34個循環，最后于72℃延伸8 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標產物（回收試劑盒），純化后與PMD 18-T載體連接，轉化DH5α感受態細胞[7]，挑選陽性白色菌落單克隆測序并在LB+氨芐青霉素(ampicillin,Amp)100 mg/L 液體培養基中振蕩擴大培養，提取重組質粒[8]經Bam H Ι/S ac Ι雙酶切、PCR 檢測驗證及測序確認序列。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 同源蛋白的搜索

根據測得的STR核苷酸序列，登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）使用ORF Finder，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，將其蛋白質序列于NCBI中進行Blastp搜索，選取部分植物的STR氨基酸序列，進行生物信息學分析。

1.2.2 STR同源基因的蛋白質氨基酸序列分析

用DNAMAN對植物STR蛋白質氨基酸序列進行多重對比分析，用MEGA5.1軟件，按Neighbor-Joining的方法，使用ClusterX分析得到的序列比對結果構建來源于植物的STR分子系統樹。

1.2.3 STR的蛋白結構分析

SOPMA(npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.HTML)進行蛋白質二級結構分析[9]，使用Target P(www.cbs.dtu.dk/services/Target P/)和 Signal P(www.cds.dtu.dk/services/Signal P)進行信號肽等結構功能分析[10]。

2 結果與分析

2.1 STR的編碼序列的獲得與生物信息學分析

RT-PCR獲得了長1 000 bp左右的特異性擴增片段，產物與載體連接、轉化DH5α進行藍白斑篩選后進行了PCR鑒定，獲得1 058 bp，其中人工引入Bam H Ι的酶切位點以及保護堿基（10 bp）和S ac Ι的酶切位點以及保護堿基（共10 bp），獲得STR基因的編碼序列1 038 bp（圖1）。對STR基因的編碼區分析結果表明，該基因編碼345個氨基酸的多肽（圖1），等電點為5.06。

圖1 STR及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Strictosidine synthase gene of Rauvolfia yunnanensis and its deduced amino acid sequence

2.2 部分植物的STR蛋白質序列多重比對

選取不同種的植物STR蛋白序列進行多重比對（圖2）。結果表明STR序列在物種之間比較保守，在前30個左右的氨基酸中，發現高度保守的纈氨酸（V）、亮氨酸（L），都是帶有脂肪側鏈的疏水氨基酸。

用MEGA5.1軟件構建來源于植物的STR分子系統樹（圖3），由圖可看出高等植物中STR分為兩種類型，一種為來源于能產生TIAs的植物，包括云南蘿芙木，蛇根木和長春花。另一種則來源于不能產生TIAs的植物，包括番茄，水稻，油菜。云南蘿芙木與長春花都來源于夾竹桃科，圖上也看出它們組成了一個亞類群。

2.3 STR的蛋白結構分析

通過SOPMA對STR的二維結果進行預測，得到STR可能由21.16%的α-螺旋，34.20%的延伸鏈，15.65%的β-轉角和28.99%的不規則盤繞組成。由圖4可看出，延伸鏈和不規則盤繞是STR蛋白的最大量結構元件，而α-螺旋和β-轉角則散布于整個蛋白質中。

圖2 幾種植物的氨基酸序列的多重比對結果Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequence of the STR from several plants

圖3 STR的分子系統進化樹Fig.3 A phylogenetic tree of the STR from various plants constructed by the neighbor-joining method on MEGA5.1

圖4 預測的STR二級結構Fig.4 The secondary structure of STR generated by SOMPA

對STR進行了Target P分析后，得到結果表明此酶與分泌途徑有關，Signal P表明它有27個氨基酸長度的信號肽，在27和28之間是信號肽的裂解位點（cleavage site）。

3 討 論

本研究首次成功克隆了云南蘿芙木的STR基因，并通過生物信息學分析表明獲得的序列確實為云南蘿芙木中的STR，而且使用生物信息學分析了云南蘿芙木中STR的蛋白質二級結構。為以后繼續深入研究云南蘿芙木中萜類吲哚生物堿代謝途徑的關鍵酶提供了基礎，為STR家族增添了新成員。分析發現一種STR來源于在能產生TIAs的植物中，另一種來源于不能產生TIAs的植物中。

關于TIAs的合成代謝途徑研究早在1950年就開始展開，1979年Treimer[11]等首次從長春花細胞懸浮培養細胞中純化分離出了異胡豆苷合成酶（STR)，此后Anthony[12]等對此酶的性質進行了進一步的研究。1988年Kutchan[13]等首次對蛇根木中STR進行cDNA克隆。Canel[14]等對長春花中STR基因進行操作，結果表明STR 基因的超量表達可以使生物堿水平提高。在其它不合成此類生物堿的植物中超量表達編碼STR 的基因，也可以導致這些植物細胞合成此類生物堿[12]。

克隆云南蘿芙木的STR基因揭示了影響云南蘿芙木中吲哚類生物堿合成代謝的調控因子中分子層面的因素，為繼續深入研究提高TIAs生物堿合成代謝產物的累積提供了基礎。

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Cloning and analysis of strictosidine synthase in Rauvolfia yunnanensis

XU Ruo-xian, CAO Fu-xiang, PENG Ji-qing, SI Shu-bin
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ By using the leaf of Rauvolfia yunnanensis Tsiang as the material, utilizing RT-PCR, the strictosidine synthase gene,which was the key intermediate in terpenoid indole alkaloids (TIAs) was cloned and its bio-information was analyzed. The analysis results indicate that the DNA has been sequenced,revealing an open reading frame of 1038 base pairs, encoding 345 amino acids,an isoelectric point of 5.06, and 27 amino acids constructed a signal peptide that attend excrete at its N-end.The prediction of its secondary structure shows that extend strand and random coil was the most quantities in STR protein and α-spiral and β-outer corner distributed in the whole protein.The homology analysis manifests that STR in Rauvolfia yunnanensis Tsiang was homologous with STRs from other plant sources. MEGA5.1 was adopted to construct the phylogenetic tree of the STR.

∶ Rauvolfia yunnanensis Tsiang ;TIAs; STR; RT-PCT; bio-information

S718.46

A

1673-923X(2012)06-0128-04

2012-03-04

云南2007年度產業化重大關鍵技術開發項目[云發改高科（2007）1718號]

許若嫻（1983—），女，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學

曹福祥（1962—），男，湖南新化人，教授，博士生導師，主要從事植物學和生物化學與分子生物學研究；E-mail：csfucao@163.com

[本文編校：吳 彬]