一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

陸 晨 ，陳介南 ，王義強(qiáng) ，詹 鵬 ，張 林

（1.國家林業(yè)局 生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004； 2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

陸 晨1,2，陳介南1,2，王義強(qiáng)1,2，詹 鵬1,2，張 林1,2

（1.國家林業(yè)局 生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004； 2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)法、剛果紅染色法、濾紙崩解法和胞外纖維素酶活性測定法，從湖北神農(nóng)架保護(hù)區(qū)不同區(qū)域采集的森林腐質(zhì)土壤中分離篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的真菌B-5。結(jié)合菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察和ITS序列同源性分析，確定該菌株為鐮刀菌屬Fusarium，與木賊鐮刀菌Fusarium equiseti相似度達(dá)99%。濾紙崩解實驗顯示該菌72 h對濾紙具有明顯崩解能力，失重率達(dá)37.9%。以羧甲基纖維素鈉為碳源，蛋白胨為氮源，28℃，180 r/min,培養(yǎng)5 d，初始酶活為FPA酶活（FPase) 2.09 IU/mL，CMC酶活（CMCase）5.20 IU/mL。通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定稻草為唯一碳源，初始pH為6.1，氮源濃度為1.0%，碳源濃度為2.5%，鼠李糖脂添加量為0.1%，F(xiàn)PA酶活達(dá)2.205 IU/mL，相應(yīng)CMC酶活為5.174 IU/mL。

纖維素酶；真菌；篩選鑒定；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

木質(zhì)纖維是自然界最豐富的可再生資源，占整個植物細(xì)胞干重的90%以上。不同植物中木質(zhì)纖維各種組分的含量是不同的，軟木中的木質(zhì)素含量比硬木高，草中的纖維素含量最高。一般來說，木質(zhì)纖維素中含纖維素45%、半纖維素30%和木質(zhì)素25%[1]。其中含量最高的纖維素必須通過纖維素酶的作用分解成還原糖的形式方可用于乙醇發(fā)酵等領(lǐng)域[2]。然而，就目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，纖維素酶活力不高是限制木質(zhì)纖維資源利用的主要因素[3]，所以選育高產(chǎn)纖維素酶的菌種是關(guān)鍵所在。產(chǎn)纖維素酶的生物種群十分廣泛，如細(xì)菌、真菌、放線菌及昆蟲、軟體動物和原生動物等，而目前主要是利用細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物發(fā)酵來獲得纖維素酶[4]。細(xì)菌類包括纖維黏菌屬、纖維桿菌屬和芽孢桿菌屬等；放線菌包括鏈霉屬、高溫放線菌屬和彎曲熱單胞菌等；真菌類包括木霉屬、曲霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、孢霉屬等[5]。本研究從自然界篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的真菌，經(jīng)鑒定為鐮刀菌屬，拓寬了產(chǎn)纖維素酶的真菌屬種，為木質(zhì)纖維的降解提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

采集地點為湖北省神農(nóng)架保護(hù)區(qū)，具體采樣地點包括大龍?zhí)丁Ⅷ喿涌凇灞趲r等地，樣品均為森林腐質(zhì)土壤。稻草粉，收集長沙縣脫谷稻草秸稈，剪成3 cm片段，烘干后用微型植物粉碎機(jī)粉碎至30～120目。

1.1.2 培養(yǎng)基

①CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g，NH4NO31 g, 酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，去離子H2O 1 000 mL，瓊脂2%，pH自然。②剛果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO40.1 %，NaCl 0.05%，CMCNa 2.0%g，剛果紅0.02%，瓊脂2.0%，pH自然。③濾紙液體培養(yǎng)基：濾紙2 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，去離子H2O 250 ml。④液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基[6]：蛋白胨3 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO44 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，去離子H2O 1 000 mL，pH自然。⑤種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨1 g/L，Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100 ml/L，Mandels微量元素濃縮液1 ml/L，1 mol檸檬酸緩沖液50 ml/L。

1.2 分析方法

1.2.1 初篩方法

利用CMC-Na培養(yǎng)基獲得純菌落，用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min[7]，再用蒸餾水清洗，最后用1 mol/L的NaCl溶液脫色30 min。以透明圈的直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，將篩選到的菌株接種到濾紙液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min，以不接種任何菌株的濾紙液體培養(yǎng)基作為空白對照，重復(fù)3次實驗，以濾紙的失重率(X)作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，X=(m-m1)/m，其中m為最初濾紙質(zhì)量，m1降解后濾紙經(jīng)烘干后的質(zhì)量。

1.2.2 復(fù)篩方法

將初篩得到的幾株菌按5%的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，取其上清液測定酶活（FPA酶活、CMC酶活）大小。

1.2.3 酶活測定[8]

FPA酶活：取四支試管，將裁剪成50±0.5 mg濾紙條折成M形沿豎直方向推到試管底部，加入0.05 mol pH4.8檸檬酸緩沖液1.5 mL，待測酶液0.5 mL（空白管不加），充分混勻后于50℃水浴放置60 min，迅速向各管加入DNS試劑3 mL，空白管加酶液0.5 mL，沸水浴放置10 min，冷卻后定容至25 mL，用空白管調(diào)零，540 nm測定OD值，以吸光度平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

CMC酶活：取4支試管，分別加入用0.05 mol pH4.8檸檬酸緩沖液配置的CMC-Na液2 mL，待測酶液0.5 mL（空白管不加），充分混勻后于50℃水浴放置30 min，迅速向各管加入DNS試劑3 mL，空白管加酶液0.5 mL，沸水浴放置10 min，冷卻后定容至25 mL，用空白管調(diào)零，540 nm測定OD值，以吸光度平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

上述酶活測定，反應(yīng)后均用DNS法測定酶解產(chǎn)生的還原糖量，酶活單位采用國際單位，1 mL酶液1 min分解底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位，以IU/mL表示。

1.2.4 形態(tài)鑒定

將菌株接種到PDA平板上，培養(yǎng)3天，觀察菌落的特征。在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，乳酸石碳酸棉蘭染色液染色后置于顯微鏡下觀察（水浸片法），參照《真菌鑒定手冊》[9]進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.5 18SrDNA序列鑒定

100 mg菌絲樣品于液氮中研磨至粉末，保存于1 mL離心管中[10]。利用酵母總DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌株總DNA，采 用 ITS1 （5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'） 和 ITS4（5'-TCCT CGCC TTAT TGAT ATGC-3'）引物擴(kuò)增菌株18SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)[11]。PCR反應(yīng)體系為50 μL，程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，51℃退火50 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后送北京六合華大基因公司測序，于NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對分析。

1.2.6 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

首先進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基單因素試驗，保持培養(yǎng)基中其他成分不變，分別改變其中的碳源、氮源、初始pH和表面活性劑（鼠李糖脂）[12]這4個因素，篩選出影響B(tài)-5菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳單因素。然后設(shè)計4因素3水平正交試驗[13]，確定產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

利用CMC-Na培養(yǎng)基分離得到9株形態(tài)不同菌種，有細(xì)菌、放線菌和真菌。剛果紅染色，均產(chǎn)生大小不一水解圈，其中B-5菌株水解圈直徑與菌落直徑比值并不是最大，見圖1。將分離得到9株菌接種到濾紙液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，測定濾紙失重率，其中接種B-5的培養(yǎng)基中濾紙條被崩解成不規(guī)則小片，整個培養(yǎng)基成糊狀，見圖2，濾紙失重率為最大，達(dá)37.9%。

圖 1 B-5菌株剛果紅染色結(jié)果Fig.1 Congo red staining of B-5

圖 2 B-5菌株濾紙崩解結(jié)果Fig.2 Results of filter paper disintegrating by B-5

2.2 復(fù)篩結(jié)果

對于以上9株菌均進(jìn)行了產(chǎn)酶實驗，它們的FPA酶活和CMC酶活見表1，可見B-5的FPA酶活和CMC酶活均最高。

表1 各菌株酶活大小Table 1 Cellulase activity of each strain IU/mL

2.3 形態(tài)鑒定

PDA培養(yǎng)基28℃條件下培養(yǎng)4天后菌落直徑達(dá)到3 cm左右，菌落起初呈粉白色，4℃保藏10天后局部呈淡黃色，見圖3。菌落表面附著孢子，絨毛狀。顯微鏡下觀察，菌絲纏繞抱團(tuán)，由單細(xì)胞鏈接而成，見圖4。通過菌落和菌絲特征，推測其為一株真菌。

圖 3 B-5菌株P(guān)DA培養(yǎng)基生長情況Fig.3 Growth of B-5 in PDA

圖 4 B-5菌株菌絲情況Fig.4 Microscopic examination of B-5’s hyphae

2.4 分子鑒定

獲得B-5菌總DNA模板后，利用ITS引物在4個退火溫度梯度下（51℃、53℃、55℃、57℃）進(jìn)行PCR反應(yīng)，均得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小700 bp左右，見圖5。測序拼接后登陸Genebank進(jìn)行Blast比對，確定其為鐮刀菌屬，與木賊鐮刀菌同源性達(dá)99%。

圖 5 B-5菌株P(guān)CR電泳圖Fig.5 PCR electrophoresis of B-5

2.5 B-5鐮刀菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.5.1 不同碳源對產(chǎn)酶活力的影響

由圖6可見，利用CMC-Na為唯一碳源時，F(xiàn)PA酶活和CMC酶活均最高（2.09 IU/mL和5.20 IU/mL），但稻草秸稈是天然可再生資源，并且作為農(nóng)業(yè)廢物利用率較低，在實際應(yīng)用方面具有優(yōu)勢，故選取稻草作為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

2.5.2 稻草添加量對FPA酶活力的影響

由圖7可見，當(dāng)?shù)静萏砑恿吭?.5%～2.5%之間時，隨著稻草添加量的增加，酶活不斷升高。當(dāng)?shù)静萏砑恿繛?.5%時，F(xiàn)PA酶活最高為1.841 IU/mL。

2.5.3 蛋白胨添加量對FPA酶活力的影響

由圖8可見，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?.2%～0.8%之間時，隨著蛋白胨添加量的增加，酶活不斷升高。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.8%時，酶活最高為1.863 IU/mL。

2.5.4 初始pH值對FPA酶活力的影響

保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不變，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值在酸性環(huán)境下逐漸升高時，酶活也不斷升高。當(dāng)初始pH值為6.1時FPA最高為1.875 IU/mL，見圖9。

2.5.5 表面活性劑對FPA酶活力的影響

保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不變，分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的鼠李糖脂（購買的制劑，鼠李糖脂含量為50%～60%）。當(dāng)鼠李糖脂添加量為0.1%時，F(xiàn)PA酶活最高為2.067 IU/mL，見圖10。

圖6 不同碳源對FPA酶活力和CMC酶活力的影響Fig.6 Effects of different carbon sources on FPase and CMCase

圖7 不同稻草添加量對FPA酶活力的影響Fig.7 Effects of different rice straw content on FPase

圖8 不同蛋白胨添加量對FPA酶活力的影響Fig.8 Effects of different amount of peptone on FPase

圖9 不同初始pH值對FPA酶活力的影響Fig.9 Effects of different initial pH value on FPase

2.5.6 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化實驗

在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)基初始pH、氮源（蛋白胨）、碳源（稻草）和表面活性劑(鼠李糖脂)這四個因素作為B-5鐮刀菌產(chǎn)酶過程中培養(yǎng)基優(yōu)化的因素，設(shè)計四因素三水平的正交試驗如表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設(shè)計Table 2 Orthogonal experimental design

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

各因素對FPA酶活影響的大小順序為氮源＞碳源＞初始pH值＞表面活性劑。從試驗結(jié)果中得出最優(yōu)組合：初始pH為6.1，氮源濃度為1.0%，碳源濃度為2.5%，鼠李糖脂添加量為0.1%，酶活最高為2.205 IU/mL。

圖10 不同鼠李糖脂添加量對FPA酶活力的影響Fig.10 Effects of different rhamnolipid content on FPase

3 結(jié) 論

本研究從原始的自然環(huán)境采集樣品，利用剛果紅染色和濾紙崩解等基礎(chǔ)方法分離篩選出產(chǎn)纖維素酶的菌種9株。鑒于細(xì)菌、放線菌和真菌的生長形式不同，剛果紅染色產(chǎn)生水解圈的大小并不能作為其產(chǎn)纖維素酶活力高低的唯一標(biāo)準(zhǔn)，于是利用濾紙的崩解效率進(jìn)行反復(fù)驗證。最后精確測定FPA酶活和CMC酶活確定產(chǎn)酶最優(yōu)的菌種B-5。菌種鑒定時，首先通過觀察菌落形態(tài)和菌絲結(jié)構(gòu)基本確定其為一株真菌，然后利用酵母總DNA提取試劑盒提取其總DNA作為模板，通過ITS1和ITS4引物擴(kuò)增其18SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對確定其為一株鐮刀菌。在產(chǎn)酶優(yōu)化實驗中，將FPA酶活力（全酶活）大小作為唯一標(biāo)準(zhǔn)，確定最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：稻草粉末25 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，Mandels微量元素濃縮液1 mL/L，1 mol檸檬酸緩沖液50 mL/L，鼠李糖脂添加量0.1%，pH為6.1。FPA酶活為2.205 IU/mL，相應(yīng)CMC酶活為5.174 IU/mL。

鐮刀菌通常作為植物甚至農(nóng)作物的致病菌進(jìn)行研究[14]，在原始森林中篩選出的B-5鐮刀菌具有較高產(chǎn)纖維素酶能力，利用稻草作為碳源時有良好的產(chǎn)纖維素酶效果。雖然酶活離預(yù)期還有一段距離[15]，但是通過其它的條件優(yōu)化仍有提高潛力，本研究不僅拓寬了產(chǎn)纖維素酶的菌譜，也為尋求稻草秸稈新的利用途徑做出了貢獻(xiàn)。

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Screening and identification of a cellulase-producing fungus and optimization of its fermentation condition

LU Chen1,2, CHEN Jie-nan1,2, WANG Yi-qiang1,2, ZHAN Peng1,2, ZHANG Lin1,2
(1. Bioethanol Research Center, Ministry of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Institute of Biological and Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ An effective cellulase-producing fungus named B-5 was isolated from the primary forest soil in different regions of the protected area in Shennongjia, Hubei, China, by using the methods of CMC-Na culture medium, Congo red staining, disintegration of filter paper and measurement of enzymatic activity of cellulose. The strain was identified as Fusarium by observing its colony morphology and microscopic characteristics as well as ITS sequence homology analysis, having the similarity of 99% with Fusarium equiseti. The filter disintegration experiments show that the fungus had strong capacity of filter decomposition in within 72 hours and the weight loss rate reached 37.9%. By taking CMC-Na as the carbon source, peptone as nitrogen source, 28 ℃, 180 r/min, cultured 5 days,the initial activity were FPAase of 2.09 IU/mL, CMCase of 5.20 IU/mL. After optimization of fermentation conditions, by taking rice straw as the sole carbon source, initial pH of 6.1, 1.0%, nitrogen concentration 0.1%, carbon concentration 2.5%, rhamnolipid addition 0.1%, the FPAase reached 2.205 IU/mL, the corresponding CMCase was 5.174 IU/mL.

∶ cellulase; fungus; screening and identification; optimum of fermentation condition

S714；S718.8

A

1673-923X(2012)06-0118-05

2012-01-17

國家公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（編號201004001）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃重點項目（編號2011WK2001）；常德市科學(xué)技術(shù)局技術(shù)研究與開發(fā)資金項目（編號2011GK06）

陸 晨（1986—），男，湖南株洲人，碩士研究生，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)；E-mail：theonlyshark32@sina.com

陳介南（1961—）， 男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jchen2002@yahoo.com

[本文編校：羅 列]